Un modèle de souris de Retinal Ischémie-reperfusion Grâce à une élévation de la pression intraoculaire

L'objectif général de cette technique est de fournir un modèle expérimental de lésion par ischémie-reperfusion rétinienne et de ses conséquences pathologiques. Cette méthode est couramment utilisée pour étudier les mécanismes sous-jacents à l'ischémie-reperfusion rétinienne, ainsi que pour évaluer des approches thérapeutiques potentielles dans le traitement des pathologies associées. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à induire une lésion fortement ciblée sur les structures oculaires, tout en causant des dommages minimes aux tissus environnants.

L'utilité de cette technique s'étend à la compréhension des multiples manifestations de l'ischémie-reperfusion rétinienne sur une période de trois mois, notamment : l'inflammation, le stress oxydatif et le dysfonctionnement des cellules étoilées dans l'unité neurovasculaire rétinienne. La démonstration vidéo de cette méthode est essentielle, car les techniques chirurgicales de pose de la canule peuvent être difficiles à reproduire sans guide visuel. Avant de commencer la procédure, réchauffez une cage vide sur la table.

Insérez ensuite l'extrémité pointue du tube en Y pré-percé du jeu primaire dans un flacon contenant du sodium héparinate à 0,1 %, puis suspendez le bas du flacon de sodium héparinate à une extension de potence pour perfusion intraveineuse. Ouvrez d'un clic le bouchon du filtre à air sur le tube. Élevez ensuite le flacon de sodium héparinate à 163 centimètres au-dessus du plan de travail jusqu'au sommet de la goutte de sodium héparinate, afin d'obtenir une pression d'écoulement de sodium héparinate équivalente à 120 millimètres de mercure.

Ouvrir le jeu de tubulure primaire pré-percé à site en Y, afin que l'héparine sodique remplisse la tubulure, puis raccorder ce jeu de tubulure à site en Y au manifold à cinq valves. Ensuite, à l'aide de raccords tubulaires mâles Luer à mâles Luer, fixer des aiguilles de calibre 30 et demi-pouce au manifold à cinq ports. Insérer chaque aiguille dans un segment de dix pouces de tubulure de calibre 30.

Ensuite, à l’aide de pinces hémostatiques, casser les extrémités de nouvelles aiguilles de calibre 30 d’un demi-pouce et insérer leurs extrémités émoussées dans les extrémités ouvertes des tubulures de calibre 30. Puis, utiliser du ruban adhésif pour disposer les tubulures en aiguille de manière que les tubulures reliées aux orifices internes soient placées au-dessus de celles reliées aux orifices externes, afin d’éviter tout enchevêtrement des tubulures pendant la canulation de la chambre antérieure. Ensuite, ouvrir l’écoulement de sodium héparinate à 0,1 % vers le collecteur à cinq voies et vers chaque orifice individuel pendant deux à trois minutes afin d’éliminer toute bulle d’air.

Ensuite, fermez tous les ports du collecteur à cinq valves. Pour réaliser la canulation, après l'administration de l'anesthésie, placez toutes les souris dans la cage chauffante sur la table chirurgicale, en confirmant l'obtention d'une anesthésie profonde par l'absence de réponse à une pincée des orteils après cinq à dix minutes. Appliquez ensuite une goutte de tropicamide pour la dilatation de la pupille et une goutte de proparacaïne pour l'anesthésie locale dans chaque œil des animaux, puis rangez les souris dans l'ordre d'anesthésie, de sorte que la première souris anesthésiée soit la première à être canulée.

Pendant que l'on attend que les gouttes ophtalmiques fassent effet, préparez des morceaux de ruban adhésif droits de quatre pouces en tirant fermement sur le ruban avant de le déchirer, et mettez de côté un morceau de ruban par animal. Notez que le fait de ne pas tirer fermement sur le ruban entraînera un enroulement du ruban. Lorsque la première souris est prête, placez l'animal sous un microscope chirurgical.

Ensuite, ouvrez le premier port de sodium héparine à 0,1 % sur le collecteur à cinq valves, et utilisez une paire de forceps pour délicatement proptoser un œil. Puis, insérez l'aiguille cannelée de calibre 30 dans la chambre antérieure, approximativement à mi-chemin entre les fibres zonulaires et l'apex de la cornée, en prenant soin d'éviter de pénétrer une deuxième fois dans la cornée.

Remarquez qu'un mouvement de rotation doux est utilisé pour insérer profondément la canule dans la chambre antérieure. Appuyez maintenant le tube de calibre 30 contre la surface de la table afin de minimiser tout déplacement de la canule insérée tout en tendant la main vers un morceau de ruban adhésif, puis utilisez ce ruban pour fixer le tube à la table. Une fois le tube fixé, enregistrez l'heure de début de l'intervention chirurgicale.

Utilisez le microscope pour vérifier l'absence de fuite et que l'œil soumis à l'ischémie-reperfusion est plus gros que l'œil controlatéral, afin de confirmer la présence d'une distension oculaire. Appliquez ensuite de l'Hypromellose sur les deux yeux toutes les 30 minutes, jusqu'à la fin de l'expérience, afin de lubrifier la cornée et de sceller d'éventuelles microfuites. Si un animal s'agite pendant la procédure, soulevez la queue et administrez une dose supplémentaire de kéta­mine par voie intrapéritonéale.

90 minutes après avoir canulé le premier animal, retirer doucement la canule de la chambre antérieure et lubrifier les deux yeux avec un gel lubrifiant. Au fur et à mesure que les canules sont retirées, replacer chaque souris dans la cage située sur la table chirurgicale, jusqu'à ce que les animaux soient complètement rétablis. Une fois toutes les canules retirées, les désinfecter avec des lingettes imbibées d'alcool.

Ensuite, utilisez une seringue de 60 millilitres remplie d'air pour expulser le sodium héparine du manifold à cinq voies, des aiguilles de calibre 30, des tubulures de calibre 30 et des canules. Rincez ensuite tous les instruments avec une seringue de 60 millilitres remplie d'eau distillée. Enfin, expulsez l'eau distillée de l'ensemble du matériel à l'aide de 60 millilitres d'air, puis rangez l'équipement désinfecté et rincé en vue d'une utilisation ultérieure.

L'immunomarquage des noyaux neuronaux par NeuN révèle une perte cellulaire neuronale significative après un traumatisme d'ischémie-reperfusion, observée par imagerie confocale sept jours après la lésion. En effet, la quantification manuelle des cellules positives pour NeuN dans les yeux témoins et ceux soumis à l'ischémie-reperfusion démontre une diminution du nombre de neurones dans la couche des cellules ganglionnaires après la lésion, indiquant la présence d'une mort cellulaire induite par l'ischémie-reperfusion. Des amplitudes réduites des ondes a et b, enregistrées par électrorétinographie, signifient également l'apparition de troubles fonctionnels neuronaux rétiniens induits par l'ischémie-reperfusion, par rapport aux yeux témoins non lésés.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée sur dix animaux en environ cinq heures, y compris les deux dernières heures consacrées à l'attente du réveil des souris de l'anesthésie. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir une anesthésie profonde. Une sédation efficace empêchera en effet tout déplacement de la canule dû aux mouvements de l'animal.

Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'électrorétinographie, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la fonction rétinienne. Cette technique a permis aux chercheurs dans les domaines de la neurosciences ophtalmologique et de la biologie vasculaire d'étudier la pathogenèse neurovasculaire rétinienne ainsi que les interventions thérapeutiques chez les rongeurs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire une lésion rétinienne ciblée par la canulation de la chambre antérieure de l'œil.

N'oubliez pas que le travail avec des instruments chirurgicaux peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l'utilisation d'un conteneur efficace pour les déchets tranchants, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.