لإعداد المائل الحبل الشوكي شرائح لبطني الجذر تحفيز

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير شرائح مائلة من الحبل الشوكي تسمح بتحفيز الجذور البطنية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحديد الهويات العصبية الحركية لتحفيز الجذر البطني ودراسة الخلايا البطنية التي تتأثر بها الضمانات المحورية العصبية الحركية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما احتجنا إلى طريقة موثوقة لتحفيز الخلايا البطنية.

سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب صعوبة تنفيذ خطوات التشريح المختلفة بشكل صحيح. ابدأ بزرع ماوس P2 إلى P11 باستخدام ACSF منخفض الصوديوم. بعد قطع رأس الفأر وإزالة الجلد من الظهر ، قم بعمل قطعتين من خلال الكتفين وأسفل القفص الصدري.

بعد ذلك ، قم بقطع الحبل الشوكي إلى أدنى مستوى ممكن في الجزء الذيلي لعزل العمود الفقري والأضلاع من الجزء السفلي من. اقلب العمود الفقري وقم بإزالة الأحشاء التي لا تزال متصلة بالأضلاع. انقل العمود الفقري إلى طبق بتري آخر أصغر مملوءا بالسيليكون.

أضف ACSF البارد والفقاعات مع الكربوجين واستخدم أربعة دبابيس حشرية لتثبيت الجانب الظهري للأنسجة لأعلى. ثم قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية للجانب الظهري عن طريق إدخال طرف المقص الناعم أولا بين العظم والحبل الشوكي وقطع العظم من الطرف المنقاري ، مع التأكد من الابتعاد عن المادة البيضاء. قم بتبديل الجروح على كل جانب أثناء استخدام الملقط لتثبيت شريط العظام المقطوع بالفعل.

بعد ذلك ، استخدم ملاقط صغيرة لرفع الجافية والمقص الصغير لقطع الوصول الذيلي المنقاري على كلا الجانبين. إزالة الجافية هي خطوة حاسمة. يجدر قضاء بضع دقائق إضافية للقيام بذلك بدقة.

بمجرد إزالة الجافية ، استخدم طرفا زجاجيا غير حاد لدفع الحبل برفق نحو الجانب الأيسر من الأخدود المتكون من العمود الفقري نصف المقطوع. ثم قم بقطع الجذور البطنية والظهرية على الجانب المشرق قدر الإمكان من مكان دخولها إلى الحبل. كرر العملية على الجانب الأيسر ، وانتقل دائما من المنقاري إلى الذيلي.

بعد التشريح ، قم بإخراج الحبل الشوكي من العمود الفقري. ثم استخدم دبوسا صغيرا للحشرات لتأمين الحبل للسطح الظهري. قم بإزالة أي قطع من الغشاء المرفق بدقة.

بمجرد التنظيف ، قم بقص طرفي الحبل وأدخل دبوس حشرة مثني في الجزء الأمامي من الحبل لتحديد اتجاهه. ثم انقل الحبل الشوكي إلى محلول داخل الخلايا المثلج. بعد ذلك ، قم بتبريد الأجار المنصهر المعد مسبقا على خليط من الثلج والماء.

حرك الأجار أثناء قياس درجة الحرارة. عندما تصل درجة حرارة الأجار إلى 38 درجة مئوية ، أمسك الحبل الشوكي بدبوس الحشرة واغمره في الأجار ، بحيث يكون جانب الظهر لأسفل. تأكد من أن الحبل الشوكي مستقيم قدر الإمكان ، بعيدا عن الجدران ، مع الجزء الذيلي لأعلى قليلا.

اترك الدورق في خليط الثلج والماء للسماح للأجار بالتصلب حول الحبل في أسرع وقت ممكن. بعد التصلب ، قم بقطع كتلة الأجار التي تحتوي على الحبل الشوكي بحيث تكون قاعدة الكتلة بزاوية 35 درجة مع الجزء القطني من الحبل. يجب أن يكون السطح الظهري متجها بعيدا عن القاعدة.

قم بلصق الكتلة في غرفة الاهتزاز باستخدام غراء سيانواكريلات. من الأهمية بمكان تركيب الكتلة بشكل صحيح للحفاظ على استمرارية حمامات السباحة الحركية مع الجذور البطنية التي تخرج منها. اغمر الكتلة في محلول غلوكونات البوتاسيوم.

قم بتعيين معلمات الاهتزاز. بعد ذلك ، قم بقص 350 400 ميكرون شريحة من منطقة أسفل الظهر ، والتي يمكن التعرف عليها من خلال انحناءها وقطرها الأكبر. انقل الشرائح المناسبة إلى ACSF على حرارة 34 درجة مئوية.

عادة ، هناك أربع إلى خمس شرائح مناسبة ذات جذور بطنية تمتد ملليمترين أو أكثر. بعد حوالي 30 دقيقة عند 34 درجة مئوية ، قم بتبريد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم ابدأ جلسة التسجيل. قم بإعداد صندوق من الماصات المختلفة بأقطار أطراف تتراوح من 40 إلى 170 ميكرون مسبقا.

لتحضير ماصات المقطع، حدد الماصات ذات الطابع الطويل. بعد ذلك ، باستخدام سكين ماسي ، قم بعمل قطع في مواضع مختلفة وتحت مجهر تشريح ، قم بكسر كل ماصة عن طريق ضرب الحافة بالملاقط. بعد ذلك ، قم بإزالة الغرفة من مجهر التسجيل وضعها تحت مجهر تشريح.

حدد شريحة تحتوي على جذر بطني بطول كاف ليتم تركيبه على قطب كهربائي لتحفيز الشفط. قم بتركيب الشريحة ، وتوجيهها مع الجذور البطنية لأعلى ، ثم قم بقص الأجار بدقة حول الجذور البطنية مع ترك باقي الأجار حول الشريحة وضع الشبكة لتثبيت العينة لأسفل. قم بتركيب الغرفة مرة أخرى على المجهر وقم ببث غرفة التسجيل باستمرار باستخدام ACSF بمعدل واحد إلى ملليلتر في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام ماصة زجاجية مملوءة ب ACSF ومتصلة بحقنة ، تمتص أحد الجذور البطنية. من أجل تحقيق تحفيز جيد للجذر البطني ، يجب أن يكون طرف الماصة مشدودا حول الجذر البطني. حقق تسجيل المشبك الرقعة لنوع الخلية المطلوب وسجل تأثير تحفيز الجذر البطني كما هو موضح سابقا.

توضح هذه الصورة النتائج من تسجيل مشبك الجهد. يتم أخذ تسجيلات الألواح العلوية من خلايا عصبية حركية مختلفة عن تلك الموجودة في الألواح السفلية. تظهر اللوحة العلوية الاستجابة المضادة للخلايا العصبية الحركية لتحفيز فولت واحد باللون الأحمر ، وتحفيز خمسة فولت باللون الأسود.

يظهر التتبع السفلي استجابة جهد الفعل التقويمي لتحفيز 20 فولت باللون الأحمر ، وتحفيز 30 فولت باللون الأسود. تشير النقاط السوداء إلى توقيت التحفيز. تؤكد رؤوس الأسهم المزدوجة على الفرق في زمن الانتقال بين المسامير المضادة للعظام والمضادة.

هنا ، يتم عرض تسجيلات المشبك الحالية. تظهر اللوحة العلوية الاستجابة المضادة لتحفيز 10 فولت و 15 فولت باللونين الأحمر والأسود على التوالي. تظهر اللوحة السفلية الاستجابة المتعامدة لتحفيز 25 و 40 فولت باللونين الأحمر والأسود ، على التوالي.

مرة أخرى ، يشار إلى توقيت التحفيز والاختلافات في زمن الانتقال. تم الحصول على هذه الصورة لتجمع خلايا Renshaw باستخدام مكثف مائل وهدف 20x. لاحظ أن محاور الخلايا العصبية الحركية تندمج في الجذر البطني كما هو موضح في السهم.

تم التقاط هذه الصورة لنفس المنطقة باستخدام هدف 40x. يشار إلى خلايا Renshaw المفترضة برؤوس الأسهم. يظهر هنا تسجيل مشبك الجهد لخلية Renshaw بعد تحفيز الجذر البطني ، المشار إليه بالنقطة السوداء.

منع QX-314 في المحلول داخل الخلايا الخلية من إطلاق النار وتم حظر استجابات الجلايسين والجابا بواسطة 3 ميكرومولار جابازين وستركنين ميكرومولار واحد ، على التوالي. الأثر الأحمر هو متوسط الأثر الرمادي. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في 20 أو 30 دقيقة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء المستحضر في وسط بارد في جميع الأوقات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح مائلة من الحبل الشوكي مناسبة لتحفيز الجذر البطني. يمكن استخدام تحفيز الجذر البطني لتأكيد الهوية العصبية الحركية بسهولة ، والأهم من ذلك ، لتحفيز الخلايا البطنية بشكل موثوق.