L'Assemblea e l'applicazione di "Shear Anelli ': A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio

L'obiettivo generale di questo modello è quello di creare un metodo semplice ed economico per studi in vitro sul flusso periodico dei fluidi e sullo stress di taglio sulle cellule endoteliali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia delle cellule endoteliali. Ad esempio, in che modo il taglio periodico influisce sulla forma, la struttura e il funzionamento delle cellule endoteliali.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un dispositivo di coltura tissutale assemblato semplicemente, che fornisce superfici relativamente ampie per la valutazione delle risposte cellulari. A dimostrare questa procedura, sarà il signor Luke White, uno studente di medicina nel mio laboratorio. Inizia questa procedura utilizzando il software di presentazione per creare un modello di costruzione dell'anello di taglio con un profilo del bordo esterno di 150 millimetri e un diametro interno di 100 millimetri posizionato al centro del cerchio di 150 millimetri.

Stampa il modello su un foglio di carta bianca A4. Lavorando sotto una cappa aspirante con ventilazione adeguata e indossando guanti, pipettare 10 millimetri di cloruro di metilene in una capsula di Petri di vetro da 150 millimetri. È fondamentale che il piatto sia di vetro, poiché il cloruro di metilene solubilizza la maggior parte delle materie plastiche.

Allineare una piastra di Petri di plastica da 150 millimetri sulla dima di taglio esterna. Utilizzare un utensile rotante per praticare un foro di tre 3 millimetri al centro di un piatto da 100 millimetri. Rimuovere eventuali trucioli di plastica prodotti dalla perforazione.

Tenendo la capsula di Petri da 100 millimetri con una mano guantata, capovolgere e immergere il bordo superiore della capsula nella pozza di cloruro di metilene per circa tre secondi. Lasciare che il cloruro di metilene in eccesso goccioli dal piatto da 100 millimetri, quindi trasferire rapidamente il bordo del piatto bagnato verso il basso al centro del piatto da 150 millimetri. Allineare con cura il piatto da 100 millimetri sulla sagoma contrassegnata.

Ruotare delicatamente il piatto da 100 millimetri in senso orario e antiorario alcune volte per garantire una buona adesione al piatto da 150 millimetri. Una volta che il cloruro di metilene si è asciugato, capovolgere le piastre di Petri appena legate e ispezionare attentamente i punti di contatto. Se non si è formata una chiusura ermetica, iniettare 0,5 millilitri di cloruro di metilene attraverso il foro da 3 millimetri con una pipetta di trasferimento.

Prendi il piatto e ruotalo delicatamente per consentire al cloruro di metilene di raggiungere il bordo. Dopo essersi assicurati che si sia formata una tenuta ermetica tra le due piastre di Petri, sigillare il foro nella piastra da 100 millimetri applicando un cordone da 3 millimetri di sigillante in gomma siliconica. Utilizzando un utensile rotante dotato di una testa di taglio piatta, tagliare la parte superiore di 3 centimetri di una provetta per coltura tissutale in polistirene conocole da 15 millimetri, lasciando almeno un centimetro della provetta sotto il tappo.

Utilizzare il lato piatto della testina di taglio per lucidare il bordo del tubo tagliato fino a renderlo liscio e piatto. Rimuovere eventuali trucioli di plastica prodotti dalla molatura. Con un pennarello, traccia il tubo di concole da 15 millilitri tagliato sul coperchio del piatto da 150 millimetri a circa 0,5 centimetri di distanza dal bordo del piatto.

Praticare un foro all'interno del cerchio disegnato, lasciando un margine di circa uno o due millimetri dal bordo del cerchio. Posizionare la parte superiore del tubo conocole tagliata sopra il foro praticato. Usando una pitette di trasferimento, applicare circa un quarto di millilitro, o 250 microlitri di cloruro di metilene, sui bordi tagliati del tubo di conocole per legare il tubo di conocole al coperchio da 150 millimetri.

Infine, sigillare il coperchio da 150 millimetri sulla piastra da 150 millimetri applicando un cordone di sigillante in gomma siliconica spessa un millimetro attorno al bordo interno della piastra di Petri superiore. Viene mostrato uno schema di un anello di scottatura assemblato. Il blu rappresenta l'area delle cellule endoteliali placcate.

Le frecce rosse esterne e interne indicano il movimento orbitale dell'anello di taglio e del fluido all'interno dell'anello di taglio quando posizionato su uno scuotitore orbitale. Prepararsi per la sterilizzazione pipettando circa 10 millimetri di PBS nell'anello di taglio appena formato, attraverso la porta del tubo conocole da 15 millilitri. Agitare per rimuovere eventuali detriti all'interno dell'anello di taglio.

Rimuovere il PBS con una pipetta Pasteur e un aspiratore a vuoto. Ripetere il lavaggio PBS fino a rimuovere tutti i detriti. Per sterilizzare l'anello di taglio verrà utilizzata una combinazione di risciacquo con etanolo al 70% e irradiazione UV.

Svitare il tappo con sfiato, pipettare circa 10 millilitri di etanolo al 70% attraverso la porta di accesso e riavvitare il tappo. Ruotare e capovolgere più volte l'anello di scottatura assicurandosi che l'interno dell'anello di scottatura sia accuratamente lavato. Sotto una cappa di coltura tissutale, aspirare l'eccesso di etanolo al 70%.

Con un flacone spray, spruzzare accuratamente la porta di accesso e il tappo con etanolo al 70%. Posizionare quindi l'anello di taglio e il tappo sotto i raggi UV nella cappa di coltura tissutale fino a completa asciugatura. Una volta che l'anello di sicurezza è asciutto, riavvitare il tappo.

Conservare gli anelli di taglio sterilizzati a temperatura ambiente fino a quando non vengono utilizzati nella placcatura di colture cellulari. Per prepararsi a uno studio sullo stress da taglio, prima piastrate le cellule endoteliali in anelli di taglio sterilizzati seguendo il protocollo standard di coltura cellulare. Lasciare che la coltura raggiunga la confluenza prima di iniziare gli studi di flusso.

Quando le celle hanno raggiunto la confluenza, posizionare gli anelli di taglio sperimentali su un agitatore orbitale posizionato sul ripiano inferiore dell'incubatore per ridurre al minimo lo stress e le vibrazioni del ripiano. Posizionare gli anelli di taglio del gruppo di controllo statico all'interno della stessa incubatrice. Lasciare gli anelli di taglio sull'agitatore per la durata desiderata dell'applicazione della sollecitazione di taglio.

Dopo che gli strati cellulari sono stati esposti al taglio per il periodo di tempo desiderato, rimuovere gli anelli di taglio dall'incubatore. Estrarre il coperchio dell'anello di taglio e recuperare le celle e/o i terreni per l'analisi del punto finale desiderato. Si noti che dopo aver aperto gli anelli di taglio, gli investigatori possono raccogliere cellule e terreno per l'analisi utilizzando diversi metodi.

Sono mostrati i risultati rappresentativi della comparsa di monostrati di cellule endoteliali cerebrali CMEC D3 umane in anelli di taglio, dopo 48 ore di taglio periodico del fluido o esposizione statica, è stato osservato che l'allineamento della coltura non è sempre parallelo alla direzione del flusso indicata dalle frecce. Alcune risposte al taglio periodico sono mostrate nei monostrati di cellule endoteliali microvascolari retiniche di ratto. 72 ore di taglio periodico del fluido negli anelli di taglio hanno determinato una riduzione significativa della molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche rispetto al controllo del carico di beta-actina.

Una volta padroneggiati, diversi anelli di taglio possono essere costruiti in circa tre ore se eseguiti correttamente Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di allineare attentamente il piatto interno con il piatto esterno e che si formi una tenuta ermetica tra di loro. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come costruire e utilizzare gli anelli di taglio come metodo semplice per eseguire studi periodici in vitro sul flusso di fluidi e sullo stress di taglio sulle cellule endoteliali. Non dimenticare che lavorare con il cloruro di metilene può essere pericoloso e le precauzioni, come lavorare sotto una cappa aspirante, dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione delle misure che lo richiedono.