Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi Mycobacterium tuberculosis

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare in modo riproducibile strutture aggregate di macrofagi infettati da mycobacterium tuberculosis in un formato di piastra a 96 pozzetti per test di suscettibilità ai farmaci utilizzando un colorante di vitalità. Questo metodo può migliorare il processo di sviluppo precoce dei farmaci per i composti antitubercolari, che è ostacolato dalla traduzione improduttiva dei composti candidati in ambito clinico. Il vantaggio principale di questo modello di infezione semplice ed economico compatibile con BSL two è che ricapitola le barriere di penetrazione cellulare fisiologicamente rilevanti, che ricordano i granulomi della tubercolosi.

Ciò produce risultati di suscettibilità ai farmaci più predittivi dell'efficacia in vivo. Iniziare questa procedura preparando una proteina fluorescente verde che esprime M. tuberculosis MC al quadrato 6206, di seguito denominata MTBGFP, per l'infezione. Tieni presente che si tratta di un ceppo avirulento, quindi tutto il lavoro nel protocollo qui descritto può essere eseguito in una struttura di livello due di biosicurezza.

Per ogni piastra a 96 pozzetti da impostare, centrifugare a 2,8 volte 10 fino all'ottavo MTBGFP a 3, 200 volte G per cinque minuti in una centrifuga a secchiello oscillante. Dopo la centrifuga, aspirare il surnatante e aggiungere cinque millilitri di RPMIC per lavare i batteri. Pipettare su e giù per risospendere la cellula.

Quindi centrifugare di nuovo. Dopo la seconda centrifuga, versare il surnatante e risospendere le cellule batteriche in sette millilitri di RPMIC, quindi agitare per 10 secondi. Successivamente, per ogni piastra da 96 pozzetti da installare, centrifugare sette volte 10 alla sesta cellula monocitica umana THP1 a 250 volte G per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, versare il surnatante e risospendere le cellule THP1 in sette millilitri di RPMIC. Successivamente, preparare una piastra a 96 pozzetti per l'infezione aggiungendo 200 microlitri di acqua sterile ai pozzetti nelle file A e H e nelle colonne uno e 12. Questo bordo d'acqua impedirà l'evaporazione del terreno di coltura.

Aggiungere 200 microlitri di RPMIC alla colonna due, da B due a G due, per il controllo dello sfondo o per lo spazio vuoto. Per infettare il monocita THP1, utilizzare una pipetta per trasferire l'intera sospensione batterica MTBGFP preparata nella sospensione cellulare THP1 e mescolare pipettando su e giù. La densità cellulare finale di THP1 è cinque volte 10 al quinto per millilitro e la corrispondente duplicità dell'infezione è 40.

Successivamente, versare la sospensione THP1 MTBGFP in un serbatoio da 25 millilitri e, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri di sospensione THP1 MTBGFP in tutti i restanti 96 pozzetti, da E tre a G 11. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius, con il 5% di CO2 per sette-10 giorni. Ogni due giorni durante l'incubazione, utilizzare una pipetta multicanale per cambiare il terreno rimuovendo lentamente 100 microlitri di terreno esaurito dalla parte superiore di ciascun pozzetto e aggiungendo delicatamente 100 microlitri di RPMIC preriscaldato.

Quando si cambia il substrato è importante fare attenzione a non disturbare gli aggregati macrofagi MTB sul fondo dei pozzi. Ogni giorno esamina visivamente i pozzetti utilizzando un microscopio a fluorescenza, dotato di set di filtri a campo chiaro e GFP con un obiettivo da quattro a 10 X. Prendere nota delle dimensioni degli aggregati di macrofagi MTB e acquisire immagini se lo si desidera.

Entro il giorno da sette a 10 aggregati di macrofagi MTB dovrebbero essere sufficientemente grandi per procedere con i test di efficacia del farmaco, come descritto più avanti nel video. Per i test antidroga, preparare due farmaci antitubercolari in triplicato su una nuova piastra a 96 pozzetti come segue. Innanzitutto, aggiungere 125 microlitri di terreno 7H9C ai pozzetti da B due a G 10.

Successivamente, preparare i due farmaci al doppio della massima concentrazione finale desiderata in un millilitro di 7H9C. Utilizzando una pipetta, aggiungere 250 microlitri di ciascun farmaco ai pozzetti B, C e D 11 e poi E, F e G 11 rispettivamente per i trattamenti in triplice copia. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, diluire in serie i farmaci in esame di due volte spostando 125 microlitri da B 11 a G 11 in B 10 a G 10

Miscelare pipettando cinque volte ad ogni passaggio. Continuare a spostare 125 microlitri da una colonna all'altra da destra a sinistra attraverso la piastra e fermarsi dopo la colonna quattro. Dopo aver miscelato la colonna quattro, gettare 125 microlitri in un contenitore per rifiuti.

Le colonne due e tre non devono contenere alcun farmaco. Ciò consentirà loro di essere utilizzati come sfondo e per controlli positivi della crescita. Successivamente, recupera la piastra a 96 pozzetti contenente i macrofagi infetti da MTB dall'incubatore.

Senza inclinare la piastra, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere 150 microlitri di terreno dai pozzetti da B 2 a G 11. Quindi inclinare la piastra come mostrato qui, inserire i puntali della pipetta nel bordo inferiore dei pozzetti e rimuovere il terreno rimanente, circa 50 microlitri. Poiché gli aggregati di macrofagi MTB aderiscono al fondo del pozzo, nessun materiale deve andare perso.

Tuttavia, la rimozione del terreno deve essere il più delicata possibile e occorre prestare attenzione per evitare la risospensione durante questo processo. Aggiungere delicatamente 100 microlitri di terreno 7H9C ai pozzetti da B due a G 11 della piastra, che contengono gli aggregati di macrofagi MTB. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri della piastra da 96 pozzetti del farmaco ai pozzetti corrispondenti della piastra di infezione.

Quindi posizionare la piastra in un sacchetto sigillato e incubarla per tre giorni a 37 gradi Celsius. Il saggio della resazurina si basa sulle specie ossidative prodotte da MTB metabolicamente attive per convertire la resoruprina blu in resorufina rosa fluorescente. Il cambiamento di colore e fluorescenza può essere utilizzato come marcatore surrogato per determinare la quantità di crescita batterica.

Preparare una soluzione madre di resazurina alla concentrazione finale di 8 milligrammi per millilitro in acqua. Filtrare attraverso una membrana in PVDF con pori di 22 micrometri per la sterilizzazione. Preparare una soluzione di lavoro in resazurina mescolando la soluzione madre, l'acqua e Tween-80 in un rapporto di due a uno a uno.

Le concentrazioni finali sono 4 milligrammi per millilitro di resazurina e 5% di Tween-80. Utilizzando un lettore di piastre, impostare un programma per leggere la fluorescenza a 530 nanometri di eccitazione e 590 nanometri di emissione per 24 ore ogni 30 minuti a 37 gradi Celsius. Preriscaldare il lettore di piastre a 37 gradi Celsius.

Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 microlitri di soluzione di lavoro di resazurina ai pozzetti da B due a G 11 della piastra trattata con il farmaco. Posizionare la piastra sul lettore e avviare il programma. Per confermare la robustezza dell'adattamento di questo modello di infezione al formato di piastra a 96 pozzetti, è stata valutata la suscettibilità della rifampicina MTB RIF nella moxifloxacina moxy, come descritto in questo video.

Come mostrato qui, le strutture aggregate dei macrofagi MTB sono state generate con successo in un formato di piastra a 96 pozzetti, consentendo così la compatibilità con le put. Per misurare quantitativamente la conversione della resazurina come indicatore della crescita batterica, la fluorescenza dei singoli pozzetti è stata monitorata cineticamente per 24 ore. La presenza di celle MTB vitali è determinata dalla conversione del colorante blu di resazurina nella sua forma rosa ridotta, che viene riflessa quantitativamente dai reticoli z di fluorescenza relativa al punto di saturazione.

Questi mini grafici rappresentativi mostrano le unità di fluorescenza risultanti mostrate sull'asse Y rispetto al tempo mostrato sull'asse X. Per generare curve di uccisione della suscettibilità ai farmaci, i pozzetti trattati con rifampicina e moxifloxacina sono stati normalizzati alla crescita massima di MTB senza controllo del farmaco come sopravvivenza del 100%. I segnali in bianco di controllo dello sfondo sono stati sottratti da ogni pozzetto del campione.

La percentuale di sopravvivenza è stata tracciata per ogni singola concentrazione di trattamento farmacologico per generare una curva di uccisione. Questi dati mostrano che la concentrazione inibitoria minima definisce la concentrazione più bassa dell'antibiotico alla quale si osserva un'inibizione della crescita del 90% maggiore di due microgrammi per millilitro, sia per la rifampicina che per la moxifloxacina contro MTB derivata dal nostro modello di infezione. Pertanto, la concentrazione inibitoria minima di questi due farmaci contro la MTB utilizzando il nostro modello di infezione e il nostro saggio riflette maggiormente l'attività di questi farmaci in vivo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare in modo affidabile e riproducibile strutture aggregate di macrofagi infetti da MTB per test di suscettibilità ai farmaci utilizzando il test della resazurina. Seguendo questa procedura, è possibile modificare il modello di farmaco da due farmaci, come mostrato in un pannello di 58 librerie di farmaci, per consentire lo screening dei farmaci ad alto throughput.