대사 지원 Excised, 자기 공명 현미경 중 생활 뇌 조직

이 절차의 전반적인 목표는 자기 공명 현미경 데이터를 수집하는 동안 살아있는 조직 샘플에 유리한 대사 조건을 제공하는 것입니다. 이 방법은 살아있는 세포 및 기타 미세한 조직 구성 요소의 MR 대비 특성을 밝힘으로써 의료 이미징 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 MR 스캐너 내부의 관류수 조건에 대한 정밀한 제어를 보장하고 이미지 획득 중에도 관류액의 지속적인 흐름을 허용한다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 코일 프로브와 산소 공급기 하드웨어의 조립이 복잡하고 설명하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 실험을 위해 인공 뇌척수액 또는 aCSF 관류액을 준비하려면 이전에 준비한 aCSF를 주변 온도로 평형화하는 동시에 최소 1시간 동안 직접 버블링을 통해 95% 탄수화물로 가스를 주입합니다. aCSF가 원하는 온도와 탄수화물 포화도에 도달하면 pH 측정기 프로브를 aCSF 유체에 배치하여 pH가 생리학적 범위에 있는지 확인합니다.

건강한 조직 대사에 적합한 용존 산소 함량과 pH 조건을 유지하려면 실험 중에 가스를 관류액 저장소로 직접 계속 버블링합니다. 프라이밍 절차를 시작하기 전에 돌출 라인 배치가 프로브 본체 조립 또는 보어에 프로브 삽입을 방해하지 않는지 확인하십시오. 풍성한 라인을 프라이밍하려면 연동 마이크로 펌프에 연결된 흡입 튜브를 준비된 aCSF에 담그십시오.

그런 다음 산소 공급기 장치와 풍성한 라인을 자석 보어와 그라디언트 코일 스택을 통해 위에서 아래로 통과시킵니다. 프로브가 조립될 때까지 코일을 따로 보관하십시오. CSF 폐수를 잡으려면 비커 위에 산소공급기를 걸어두십시오.

의도한 분당 2밀리리터 유속을 선택하고 확인합니다. 펌프를 켜서 풍성한 라인을 채우기 시작합니다. 빈 인라인 버블 트랩을 반전시켜 CSF로 내부 공기를 이동합니다.

다음으로, 산소 공급기의 가스 포트를 두 번째 탄화물 공급원에 연결하면서 분당 16리터의 유량을 설정합니다. 탄소가 산소공급기의 가스 교환막을 통해 흐르는지 확인하려면 산소공급기 상단의 배기구를 물에 담그십시오. 풍성 챔버에서 CSF가 떨어지기 시작하면 유입 라인을 수동으로 교반하여 눈에 보이는 가스 기포를 방출합니다.

그런 다음 풍력 챔버에서 흘러나오는 aCSF에 산소 전극을 담그고 산소 공급기가 올바르게 작동하는지 확인합니다. 안락사된 쥐의 두개골에서 뇌를 제거한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 엎드린 자세로 되돌립니다. 뇌의 중앙 부분을 포함하는 해마를 분리하려면 직선 면도기를 사용하여 횡면을 따라 두 개의 절단을 만들어 횡단 열구와 흉부에 있는 모든 조직을 제거합니다.

그런 다음 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 중앙 부분의 가장 큰 평면을 Vibratome 절단 수조의 중앙에 부착합니다. 얼음처럼 차갑고 기포가 일어난 aCSF를 추가한 다음 나일론 고정 하드웨어를 Vibratome 절단 수조 내부에 놓습니다. 다음으로, 300마이크로미터 두께의 슬라이스를 잘라 반구당 3-4개의 사용 가능한 슬라이스를 얻으면 총 6-8개의 슬라이스가 됩니다.

메스와 마이크로 겸자를 사용하여 한쪽 반구에서 해마 또는 피질 단면을 분리하고 마이크로 코일의 5mm 직경 조직 웰에 맞도록 슬라이스를 다듬습니다. 마이크로 코일을 준비하려면 전사 피펫을 사용하여 Vibratome의 절단 수조에서 산소가 공급된 aCSF로 조직 챔버를 채웁니다. 다음으로, 전사 피펫을 사용하여 트리밍된 뇌 샘플을 마이크로 코일의 조직 웰에 넣습니다.

해부 현미경을 사용하여 마이크로 코일 위에 관심 영역을 배치합니다. 이미징 실험 내내 샘플 위치를 유지하려면 나일론 와셔에 부착된 나일론 메쉬 네트와 같은 조직 유지 장치를 삽입합니다. 포집 성분을 삽입한 후 올바른 샘플 배치를 육안으로 확인하는 것은 조직의 위치를 조정할 수 있는 마지막 기회가 되기 때문에 매우 중요합니다.

다음으로, 수정된 마이크로 코일 어셈블리를 테이블 cl에 고정합니다.amp 그리고 산소공급기의 아세톨 지지 페그를 마이크로 코일 상단의 구멍에 삽입합니다. 그런 다음 풍력 챔버를 마이크로 코일의 조직 웰 위에 놓고 함께 꽉 쥐어 풍력 시스템을 밀봉합니다. 와이어 커터를 사용하여 여분의 케이블 타이를 다듬습니다.

밀봉이 성공적으로 완료되면 aCSF가 유출 라인을 통해 수집 튜브로 떨어지기 시작합니다. 마이크로 코일과 산소공급기 어셈블리를 이미징 프로브 본체 상단에 부착합니다. 마지막으로, 그래디언트 스택을 어셈블리 위로 밀어 넣고 그래디언트를 프로브 위에 장착합니다.

조립된 프로브를 자석 구멍에 삽입하려면 먼저 프로브 본체를 자석 바닥의 분광계 구멍 구멍에 가깝게 놓습니다. 그런 다음 자석 상단의 보어 구멍을 통해 과도한 길이의 관류 라인을 집어넣습니다. 풍성한 라인에서 사용 가능한 모든 여유를 제거한 후 프로브 본체를 베이스의 자석 구멍으로 전진시킵니다.

동시에 보어 상단에서 풍성한 라인에서 더 많은 느슨함을 제거하십시오. 그런 다음 두 개의 고정 나사를 프로브 바닥에 있는 심 스택의 해당 슬롯에 고정합니다. 진행하기 전에 유출 라인을 폐기물 저장소에 고정하고 CSF 유출을 확인하여 프로브 삽입 중에 관류 라인이 끼이거나 꼬이지 않았는지 확인합니다.

프로브 본체를 연결한 후 이미지 수집을 시작합니다. 내경 산소공급기가 제대로 작동하는 경우 여기에 표시된 것처럼 aCSF 관류액의 용존 산소 비율이 공급 가스의 산소 농도 비율과 일치해야 합니다. 다양한 농도의 산소를 가진 탄수화물 혼합물을 공급 가스로 사용했을 때, 조직이 풍부하다는 것을 보았을 때의 산소 포화도 비율은 사용 된 혼합물 내 산소 농도의 100 %에 접근했습니다.

확산 신호 안정성 시험을 수행하고 과융합 슬라이스, 고정 및 비관류 대조군 간에 비교했습니다. 서로 다른 관류 조건에 노출된 4개의 피질 절편에서 정규화된 확산 신호 값은 안락사 후 15.5시간 동안 안정적으로 유지되며, 포름알데히드 고정 피질에서는 비관류 피질과 대조적으로 양성 대조군으로 유지됩니다. 샘플의 적절한 배치는 MR 현미경 검사에 매우 중요하며 더 빠르고 더 낮은 해상도의 파일럿 스캔에서 시각적으로 확인할 수 있습니다.

이 예비 스캔에서는 낮은 확산 가중치로 인해 피라미드 세포층과 해마의 인접 조직 간의 대비가 낮아집니다. 높은 확산 가중치에서는 피라미드 세포층과 해마의 인접 조직 사이의 대비가 증가하고 피라미드 세포층이 인접한 조직보다 어두워져 샘플이 올바르게 중앙에 있고 해부 범위 아래에 배치된 이후 이동하지 않았음을 확인합니다. 이 절차를 시도하는 동안 절편 생존력을 최대화하기 위해 가능한 한 빨리 과융합을 시작해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 MR 현미경 검사를 받고 절제된 뇌 조직에 대사 지원을 제공하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 관류액 및 용존 가스의 변화와 함께, 다른 대사 요구 사항을 가진 다른 유형의 살아있는 절제 조직을 조사할 수 있습니다.