Sondas de detección óptica de novela bacterias específicas en el tejido de pulmón humano Ex Vivo por láser Confocal Endomicroscopy

El objetivo general de esta técnica de imagen óptica es proporcionar un medio para el cribado rápido de nuevas sondas ópticas específicas de bacterias que puedan tener tratable clínica para obtener imágenes de la infección dentro del pulmón humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la imagen molecular, como si los nuevos compuestos ópticos son específicos de su objetivo y si son detectables. La principal ventaja de esta técnica es que es traducible.

La selección de sondas de diagnóstico por imágenes prometedoras mediante el uso de equipos disponibles en la clínica proporciona la confianza de que las sondas funcionarán en ese entorno. Inmediatamente antes de la toma de imágenes, retire la muestra de tejido pulmonar humano del congelador en hielo seco. A temperatura ambiente, deje que el pañuelo se descongele ligeramente para que pueda cortarse con un bisturí en secciones de uno por cuatro milímetros.

Con pinzas, coloque el tejido pulmonar humano cortado en rodajas en los pocillos de una placa de cultivo de tejido de fondo plano y transparente de 96 pocillos. Devuelva inmediatamente el tejido pulmonar humano no utilizado al contenedor de almacenamiento y colóquelo sobre hielo seco para transportarlo de vuelta al congelador a menos 80 grados centígrados. A continuación, agregue 100 microlitros de PBS a cada muestra de tejido pulmonar con una pipeta para lavar la sangre de la muestra.

Utilice la punta de la pipeta para asegurarse de que todo el tejido esté cubierto por el PBS y no se pegue a las paredes del pocillo. Retire y deseche el PBS. A continuación, pipetee 100 microlitros de bacterias marcadas con Calceína AM sin teñir o marcadas con sonda de prueba en cada pocillo que contenga tejido pulmonar.

Además, configure controles con tejido pulmonar en 100 microlitros de PBS. Primero limpie la unidad de conector de fibra de imágenes de microscopía de fluorescencia confocal con un limpiador de fibra. Frote el conector en la cinta de limpieza con un movimiento hacia adelante para eliminar el polvo y la suciedad.

Retire la tapa amarilla protectora de la parte frontal de la unidad de escaneo láser. Prepare el cubo LSU girando suavemente el cubo plateado en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que se detenga. Inserte el conector de fibra de imagen FCFM hacia arriba.

Sostenga la fibra en su lugar y gire el cubo plateado en el sentido de las agujas del reloj hasta que haga clic dos veces. Complete la conexión girando el cubo plateado en el sentido de las agujas del reloj otros 45 grados. A continuación, siga las instrucciones que aparecen para completar la calibración de la fibra de imagen FCFM.

Primero, realice la prueba de fibra de imagen FCFM presionando el botón láser de inicio en la pantalla. El láser se centrará. Seleccione viales nuevos del kit de calibración y siga las instrucciones en pantalla.

Coloque el extremo distal de la fibra de imagen FCFM en el vial amarillo y observe el aumento de la fluorescencia en el monitor. A continuación, coloque la punta de fibra en el vial rojo sin remover. Espera a que la fluorescencia desaparezca.

Finalmente, enjuague la punta de fibra en el vial azul. A continuación, realice la adquisición en segundo plano colocando la fibra de imagen FCFM en el vial azul. Presione iniciar láser seguido de calcular cuándo se convierte en una opción.

Finalmente, realice la detección de fibras colocando la fibra de imagen FCFM en el vial amarillo. Nuevamente, presione iniciar láser seguido de calcular. Durante la calibración automatizada, limpie el extremo distal de la fibra de imagen FCFM colocándola en el vial rojo durante más de 10 segundos, seguido del vial azul durante al menos cuatro segundos, según lo indicado por el software.

Para comenzar la recopilación de datos, haga clic en iniciar en la pantalla o presione el pedal izquierdo para encender el láser. A continuación, tome una imagen de cada una de las muestras de suspensión bacteriana. Inserte el extremo distal de la fibra de imagen FCFM y mueva la fibra lentamente a través de la suspensión para interrogar la muestra.

Graba vídeos de cualquier duración pulsando el pedal derecho o seleccionando los controles de grabación en pantalla a medida que la fibra se mueve lentamente por la muestra. Limpie el extremo distal de la fibra de imagen FCFM con peróxido de hidrógeno al 8% y pañuelos de limpieza de lentes entre muestras. Para obtener imágenes de cada una de las muestras de tejido pulmonar, inserte el extremo distal de la fibra de imagen FCFM en la muestra para asegurarse de que se produzca un contacto directo entre el extremo de la fibra y el tejido.

A continuación, mueva suavemente el extremo de la fibra de imagen para interrogar la muestra. Al levantar el extremo de la fibra para separarlo del tejido, el tejido se eliminará del plano focal. Sin embargo, esto se puede usar para obtener imágenes de bacterias marcadas que no están adheridas al tejido.

Graba vídeos de cualquier duración pulsando el pedal derecho o seleccionando los controles de grabación en pantalla a medida que la fibra se mueve lentamente por la muestra. Limpie el extremo distal de la fibra de imagen FCFM con pañuelos de limpieza de lentes y peróxido de hidrógeno al 8% entre muestras. Para apagar el sistema, apague el láser presionando el pedal izquierdo o haciendo clic en el botón en pantalla.

A continuación, desconecte la fibra de imagen FCFM del dispositivo CLE girando el concentrador LSU plateado en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que se detenga. A continuación, retire la fibra de imagen FCFM del concentrador de la LSU tirando suavemente del conector de fibra de la LSU. Vuelva a colocar las tapas protectoras en el extremo proximal de la fibra de imagen FCFM en la parte delantera de la unidad LSU.

Limpie y desinfecte la fibra de imagen FCFM con peróxido de hidrógeno al 8% y pañuelos de limpieza de lentes. Finalmente, coloque la fibra suavemente en la caja de almacenamiento. Abra el software e importe los archivos para su análisis seleccionando el directorio apropiado en la computadora a través del icono ir a en el panel de control del software.

Haga doble clic en cada archivo de video para abrirlos. Los videos se reproducirán automáticamente con la tabla de búsqueda de color optimizada y la tabla de colores se ajustará. Deshabilite la escala automática de intensidad haciendo clic en el botón de la varita sobre la barra de escala de intensidad.

La función se desactiva cuando no hay sombreado negro alrededor del botón. Seleccione la escala de intensidad deseada moviendo las barras mínima y máxima para obtener el mejor contraste. Utilice la herramienta de histograma al seleccionar la escala de intensidad para asegurarse de que se captura el rango dinámico más amplio.

Una vez que se haya logrado el escalado deseado, haga clic con el botón derecho sobre el botón del menú desplegable que aparece como verde predeterminado. Seleccione la opción para guardar la tabla de búsqueda. Guarde la tabla de búsqueda en la ubicación deseada.

Para cada uno de los demás videos dentro del conjunto de datos, aplique la misma tabla de búsqueda haciendo clic con el botón derecho sobre el menú desplegable verde predeterminado y seleccionando cargar tabla de búsqueda. Seleccione el archivo adecuado para aplicar una escala de intensidad coherente a todos los vídeos del conjunto de datos. Exporte los videos procesados haciendo clic en el botón del carrete de película.

Seleccione el formato de video deseado que producirá un archivo MPG. A continuación, pulsa exportar y elige la ubicación del archivo para guardar el archivo de vídeo. Las bacterias marcadas se visualizan como puntos verdes parpadeantes en el video.

La estructura del tejido pulmonar será aparente como hebras de fluorescencia ordenadas con espacio alveolar que aparecerá negro. Las bacterias Staphylococ aureus no marcadas no emiten fluorescencia cuando se obtienen imágenes mediante FCFM, lo que demuestra el requisito de compuestos de imágenes ópticas. Los estafilococos aureus marcados con éxito por compuestos fluorescentes sometidos a cribado son visibles cuando se obtienen imágenes con FCFM.

La figura muestra Staph aureus etiquetado con éxito. El tejido pulmonar humano emite autofluorescencia a 488 nanómetros. El video muestra tejido pulmonar humano fotografiado por FCFM.

Se añadieron Staphasco aureus no marcados al tejido. No se pueden ver. Sin embargo, las bacterias marcadas con éxito se pueden ver contra un fondo de tejido pulmonar humano mediante imágenes FCFM como pequeños puntos puntiagudos centelleantes.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10 minutos dependiendo del número de muestra. Al intentar este procedimiento, es importante recordar limpiar la fibra a fondo al realizar las calibraciones de configuración y entre las imágenes de muestra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar el dispositivo FCFM para la obtención de imágenes de muestras biológicas y cómo procesar los datos capturados.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la siembra de UFC, para responder a preguntas adicionales, como la determinación del número de células bacterianas y la viabilidad después del etiquetado. No olvide que trabajar con tejido humano y bacterias patógenas puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal al realizar este procedimiento.