Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

이 방법은 특수 탐색 및 관련 동작에서 세타 진동의 인과적 역할과 같은 신경 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 행동하는 마우스에서 해마 세타 진동의 빈도와 규칙성을 실시간으로 제어할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 전 대학원생인 Franziska Bender 박사입니다.

완전히 마취된 마우스를 입체성 프레임에 고정한 상태에서 시작합니다. 내측 중격 위에 구멍을 뚫습니다. 주사 바늘 끝을 파라핀 필름 조각의 바이러스 방울에 담그고 액체의 수준을 관찰하면서 분당 약 500 나노 리터로 바이러스를 조심스럽게 끌어 올립니다.

공기가 주삿바늘에 들어가는 것을 방지하려면 바이러스가 완전히 흡수되기 전에 금단 현상을 멈춥니다. 종이 티슈로 바늘을 닦으십시오. 바이러스와 오일이 기포로 분리되어 있는지 확인하고 튜브에 바이러스의 수준을 표시합니다.

바늘을 개두술 위에 놓고 첫 번째 주입 지점에서 뇌에 천천히 삽입합니다. 분당 100-150 나노리터의 속도로 450 나노리터의 바이러스를 주입합니다. 주사 후 10분 동안 기다립니다.

10분 후 바늘을 조심스럽게 0.1mm 위로 옮기고 5분 더 기다립니다. 마이크로 스트리퍼를 사용하여 광섬유가 광섬유 스풀에 계속 부착되어 있는 동안 다중 모드 광섬유에서 125마이크로미터의 클래딩을 벗겨냅니다. 그런 다음 다이아몬드 나이프를 사용하여 섬유를 약 2-3cm 길이로 자릅니다.

내부 직경이 126미크론인 지르코니아 세라믹 스틱 페룰에 광섬유를 삽입합니다. 약 0.5-1mm의 섬유가 페룰의 볼록한 쪽에서 돌출되어야 합니다. 바늘을 사용하여 페룰의 양쪽 끝에 에폭시 접착제 한 방울을 바르되 페룰의 측면에는 바르지 마십시오.

건조 후 3 미크론 입자로 다이아몬드 래핑 섬유 연마 필름을 사용하여 페룰의 볼록한 면을 연마합니다. 텅스텐 와이어 어레이를 준비하려면 먼저 여러 개의 100 미크론 실리카 튜브 가이드를 테이프 조각의 끈적한 면에 붙입니다. 그런 다음 집게를 사용하여 가이드 튜브를 통해 formvar 절연 45미크론 텅스텐 와이어를 끼웁니다.

그런 다음 메스를 사용하여 약 5mm 길이의 6 개의 에나멜 절연 미세 구리 바인딩 와이어의 양쪽 끝에서 절연체를 벗겨냅니다. 그런 다음 약 2-3cm 길이의 접지선의 양쪽 끝에서 절연체를 벗겨냅니다. 벗겨진 각 와이어를 나노 커넥터 핀에 납땜합니다.

은 전도성 페인트 한 방울을 사용하여 각 본딩 와이어를 하나의 텅스텐 와이어에 연결합니다. 건조 후 구리선을 덮기 위해 소량의 시멘트를 바르십시오. 나노 커넥터의 상부에 시멘트를 바르지 마십시오.

시멘트를 30분 이상 건조시킨 후 뭉툭한 스테인리스 스틸 가위를 사용하여 텅스텐 와이어를 5-20도 각도로 자릅니다. 마취된 동물의 깨끗한 두개골에 직경 0.8mm의 구멍 4개를 뚫는 것으로 시작합니다. 관상 봉합사에 두 개의 구멍을 뚫고 소뇌 위에 두 개의 구멍을 뚫습니다.

다음으로, 임플란트의 접지 및 안정화를 위해 스테인리스 스틸 뼈 나사를 놓습니다. 구리선에 연결된 접지 나사를 소뇌 위에 놓습니다. 전기 생리학적 기록 중 근육 인공물을 방지하기 위해 접지 나사를 시멘트로 완전히 덮으십시오.

모든 나사를 연결하는 cment 링을 만듭니다. 이식 부위 위에서 개두술을 시행한 다음 뇌 조직 표면에 약 1마이크로리터의 멸균 식염수를 바릅니다. 스테레오탁스를 사용하여 와이어 어레이를 개두술로 천천히 내립니다.

그런 다음 뇌 조직을 보호하기 위해 이식 부위 위에 약 5마이크로리터의 따뜻한 액체 왁스를 바릅니다. 와이어 어레이 주위에 시멘트를 바르고 두개골을 시멘트로 덮습니다. 미리 납땜된 접지선 또는 접지 나사에 연결된 미리 납땜된 전선에 플럭스 한 방울을 바르고 납땜 기계를 사용하여 전선을 융합합니다.

마지막으로 접지선 전체를 시멘트로 덮습니다. 패치 코드의 광 출력을 확인하십시오. 이식된 광섬유의 투과율이 50%인 경우 패치 코드 끝의 광 출력이 20밀리와트인지 확인하십시오.

헤드 스테이지 프리앰프를 이식된 커넥터에 연결하고 광섬유 패치 코드를 이식된 해마 섬유에 연결하여 광유전학적 자극을 제공합니다. 측정되는 매개 변수에 적합한 기간 동안 기준선 동작을 기록합니다. 소프트웨어를 열어 자극 생성기를 제어합니다.

파일을 클릭하고 연 다음 선택한 프로토콜 파일을 선택합니다. 다운로드를 클릭하고 시작하여 광 자극을 시작합니다. 광 펄스에 의한 세타 리듬의 제어를 관찰하십시오.

자발적인 세타 진동 동안 해마 국소 전위가 여기에서 볼 수 있습니다. 생리학적 세타 리듬의 지표인 감마 엔벨로프(gamma envelopes)에 주목하십시오. 광유전학적 동반 중 7 헤르츠의 해마 국소 전위가 여기에서 볼 수 있습니다.

파란색 줄무늬는 조명 적용의 시간 창을 나타냅니다. 여기에서 화살표로 표시된 광 펄스에 의한 위상 재설정에 유의하십시오. 10 헤르츠에서 해마 국소 전위는 광유전학적 동반을 반영합니다.

위상 고정 감마 엔벨로프(phase-locked gamma envelopes)와 지층 오리안(stratham orians)과 지층 반경(stratum radiatum) 사이의 위상 반전(phase reversal)도 동반 중에 유지됩니다. 이 기술을 마스터하면 실험 시간 4시간과 바이러스 발현에 6주가 소요됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 효율적인 바이러스 전달을 보장하기 위해 기억해야 합니다.

광섬유 임플란트를 패치 코드에 적절하게 연결하고 자발적인 국소 자기장 전위 세타 진동의 좋은 품질을 얻으십시오.