Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo das respostas imunes a patógenos transportados pelo ar sobre a dinâmica das interações das células imunes durante infecções respiratórias. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de obter imagens 4D brilhantes e estáveis do epitélio traqueal durante a cirurgia simples. Embora esse método possa fornecer informações sobre as interações entre neutrófilos e células líticas durante a infecção por influenza, ele também pode ser aplicado ao estudo de diferentes células imunes ou patógenos transportados pelo ar.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em manter uma cirurgia inflamada estável e mínima. Além disso, a análise de imagens pode ser complicada devido à presença de defeitos cardíacos. Para infecção intranasal por influenza, coloque um camundongo CD11c-YFP anestesiado de seis a oito semanas de idade na posição supina e confirme a sedação profunda por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.

Colocando a pipeta perto da narina esquerda, dispense pequenas gotículas na cavidade nasal com aproximadamente 20 segundos de intervalo, até que o camundongo tenha inalado todo o volume de 15 microlitros de inoculante PR8. Após dois a cinco minutos, entregue 15 microlitros de vírus na narina direita da mesma maneira. Quando todo o inóculo tiver sido entregue, confirme se o camundongo está respirando normalmente e coloque o animal em sua gaiola em decúbito lateral com monitoramento até a recuperação total.

Três dias após a infecção, remova os fêmures e as tíbias de um camundongo transgênico que expressa CFP e limpe suavemente os ossos com uma pinça. Corte a epífise óssea e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26 para lavar a medula óssea de cada osso com PBS frio estéril em um tubo de 50 mililitros no gelo. Quando toda a medula óssea tiver sido colhida, aspire a medula através da ponta da agulha várias vezes e filtre a suspensão celular dissociada através de um filtro de 40 micrômetros.

Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em dois mililitros de PBS frio. Em seguida, coloque cuidadosamente dois mililitros de cada um dos três gradientes de Percoll em um tubo de 15 mililitros, do mais para o menos concentrado. Em seguida, adicione cuidadosamente dois mililitros de suspensão de células da medula óssea na camada superior do gradiente para separação centrífuga do gradiente de densidade.

No final da centrifugação, remova cuidadosamente a banda da interface de gradiente de 64 e 72% e lave os neutrófilos em PBS frio. Em seguida, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de PBS fresco no gelo para contagem e ressuspenda as células em cinco vezes 10 elevado à sexta células por 100 microlitros de concentração de PBS para injeção intravenosa nos animais receptores de CD11c-YFP inoculados. 12 horas após a transferência adotiva, coloque o animal receptor anestesiado em uma prancha cirúrgica personalizada sobre uma superfície aquecida a 37 graus Celsius e remova os pelos do pescoço do camundongo raspando e tomando um creme depilatório.

Coloque o mouse acima do posicional do mouse de plástico com a cabeça fora do posicional em um ângulo que facilite a intubação da traqueia e prenda os membros anteriores, as patas e a cauda com fita cirúrgica. Aplique pomada nos olhos e desinfete a pele exposta. Em seguida, faça uma incisão de um centímetro ao longo do eixo medial do pescoço entre a parte superior do tórax e a linha que passa pelo ponto inferior da mandíbula e mova lateralmente as manchas de pele e as glândulas salivares para visualizar a traqueia.

Use uma pinça para dissecar cuidadosamente a traqueia, intubar o camundongo com um cateter e iniciar imediatamente a ventilação artificial. Use um gancho cirúrgico conectado a uma haste na placa cirúrgica para fixar a altura e a orientação do cateter e exponha a traqueia até o queixo. Circunde a traqueia com vaselina e hidrate a traqueia com algumas gotas de PBS quente.

Em seguida, cole uma lamínula em um suporte de metal e aparafuse o suporte ao tradutor XYZ para permitir que a lamínula seja colocada em cima da preparação cirúrgica. É muito importante expor e estender adequadamente a traqueia e pressioná-la levemente com a lamínula, para manter o tecido estável por tempo suficiente para a imagem. Para imagens de lapso de tempo in vivo, coloque a placa cirúrgica dentro da câmara de incubação de 37 graus Celsius do microscópio de dois fótons e adicione uma gota de água à lamínula.

Depois de centralizar a configuração e focar no tecido traqueal, defina a frequência de varredura para 800 hertz com 520 por 520 pixels, um campo de visão de 440 por 440 micrômetros e uma média de linha de um. Defina os lasers de safira de titânio para o comprimento de onda apropriado e porcentagem de potência de acordo com os fluoróforos de excitação e configure o modo de aquisição 3D e de lapso de tempo com excitação simultânea. Em seguida, defina um intervalo de 50 micrômetros ao longo do eixo z com um tamanho de passo de três micrômetros e grave as imagens a cada 30 segundos por 30 minutos.

Seguindo essa configuração experimental, imagens 4D estáveis podem ser capturadas in situ dentro da traqueia infectada durante um período de rastreamento de 30 minutos. A análise das imagens 4D revela diferenças significativas entre o movimento das células dendríticas e dos neutrófilos recrutados, com uma velocidade significativamente mais rápida demonstrada por este último. A morfologia complexa das células dendríticas causa erros frequentes no rastreamento celular, o que, por sua vez, produz rastros com duração diminuída e variação aumentada no comportamento direcional medido.

Portanto, uma métrica robusta foi criada para medir a direcionalidade considerando a duração do trajeto, revelando uma diferença significativa na direcionalidade dos neutrófilos em comparação com as células dendríticas. Além disso, o cálculo da distância entre os neutrófilos e as células dendríticas permite a detecção e análise de seus contatos ao longo do tempo, com alguns neutrófilos neste experimento representativo formando múltiplos contatos breves com células dendríticas e alguns não formando nenhum contato com células dendríticas durante o período de imagem. Além disso, o estudo da tendência média da distância entre neutrófilos e células dendríticas ao longo do tempo facilita o estudo do posicionamento global das células, enquanto a investigação da tendência em células específicas permite a caracterização do comportamento de cada célula individual.

Conhecendo este procedimento, outros métodos como a citometria de fluxo da traqueia podem ser realizados para avaliar a quantificação e caracterização de diferentes recrutamentos de células imunes na traqueia infectada. Não se esqueça de que trabalhar com qualquer cepa do vírus influenza, mesmo que adaptada ao camundongo, pode ser perigoso e que, portanto, todos os procedimentos devem ser realizados sob condições de nível dois de biossegurança.