두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법

살아있는 설치류의 온전한 뇌에서 대뇌 혈관 구조를 이미지화하고 혈류 역학을 기록하는 능력은 뇌허혈 또는 정상 뇌 생리학 연구에 적용할 수 있는 강력한 기술입니다. 여기에서는 두 개의 사진 현미경을 사용하여 꼬리 정맥에 주입된 형광 염료를 사용하여 살아있는 쥐의 신피질에서 혈류 역학을 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 원래 David Kleinfeld가 Winfred Dank에서 개발했습니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스 신경학과 카를로스 포터 카요 연구실의 리카르도 모타입니다. 이전 영상에서는 생체 내 만성 이미징 실험을 위해 두개골 창을 이식하는 방법을 보여드렸습니다. 오늘은 두개골 창을 통해 대뇌 피질의 혈류 역학을 영상화하는 절차를 보여 드리겠습니다.

이 제제는 광자 레이저 현미경을 사용하여 뇌 내부 깊숙한 곳을 이미지화할 수 있기 때문에 매우 유용합니다. 자, 시작하겠습니다. 대뇌 혈관 구조를 이미지화하기 위해 동물은 형광 염료를 정맥 주사해야 합니다.

우리가 Dexter 접합 염료를 사용하는 이유는 dextron moty가 염료가 혈액 뇌 장벽을 통과하여 혈관 밖으로 누출되는 것을 방지하기 때문입니다. 마우스는 불소, 유도 4 %, 주입 중 1.5-2 %로 마취됩니다. 다음으로, 꼬리는 26 게이지 바늘로 70 % 알코올의 면봉 3 개로 소독하고, 식염수에 용해 된 R 도민 덱스트란의 5 % 용액 75-100 마이크로 리터를 꼬리 정맥을 통해 주입합니다.

꼬리 동물의 샤프트를 따라 중간에 다이가 소변으로 배설 될 때까지 꼬리 정맥 주입 직후 이미지를 생성 할 수 있으며, ERO 도민 염료를 사용하면 분홍색으로 변합니다.형광 덱스터 염료 주입 후 약 2 시간 내에 마우스는 불소로 마취됩니다. 다시 말하지만, 유도의 경우 4%, 이미징의 경우 1.5%입니다. 마우스는 티타늄 막대를 사용하여 현미경 스테이지에 단단히 부착됩니다.tage에는 동물을 따뜻하게 유지하기 위해 열 조절 가열 패드가 포함되어 있습니다.

눈을 촉촉하게 유지하기 위해 약간의 눈 연고를 바르십시오. 두개골 창의 커버 유리는 70% 알코올로 청소됩니다. 창은 초점면과 평행하게 배치되고 시야의 중앙에 배치됩니다.

Four x Objective 아래에서는 디지털 카메라로 뇌 표면 혈관의 사진을 찍는 것이 가장 좋습니다. 이 그림은 매일 반복적으로 이미지 영역을 찾기 위해 다음 이미징 세션에서 참조 이미지로 사용됩니다. 그런 다음 4 x 대물렌즈는 Water Immersion 40 x 대물렌즈로 교체됩니다.

무대를 이동하지 않고 뷰의 디지털 사진을 촬영합니다. 다시 말하지만, 무대 조작기의 좌표는 0으로 설정됩니다. 우리는 이미지 획득 소프트웨어로 스캔 이미지를 사용합니다.

이 글은 Carls Voto의 실험실에서 Tom Paul Rudo와 Bernardo Sabatini가 MATLAB으로 작성했습니다. 다음으로 다른 모든 장비, 레이저, 파워 미터, 광 승수 튜브, 증폭기 등을 켭니다. 이미징하기에 적합한 창의 영역을 저배율로 간략하게 스캔하여 최상의 영역을 찾습니다.

이러한 항목이 식별되면 이미지화하기 위해 선택한 영역의 저배율 스택을 취하고 해당 XY 좌표에 주석을 달아 작은 혈관 또는 모세혈관의 혈류 역학을 기록합니다. 우리는 관심 용기의 최소 40미크론을 따라 라인 스캔을 사용합니다. 1초 동안 지속되는 이러한 단일 스윕은 가능한 한 적은 레이저 출력을 사용하여 수행되며 스캐닝 좌표와 각도가 기록됩니다.

이미징 세션이 끝나면 동물은 마취에서 회복할 수 있는 따뜻한 방으로 옮겨집니다. 여기에서 우리는 꼬리 정맥을 통해 r Domine dextran을 주입 한 5 개월 된 마우스의 체성 감각 피질 위에 배치 된 두개골 창을 통해 2 개의 광자 현미경으로 5 미크론마다 촬영 한 100 개의 이미지 스택을 보여줍니다. 이 일련의 이미지는 모세혈관을 포함한 크고 작은 혈관의 복잡한 네트워크를 보여줍니다.

우리는 방금 두개골 창을 통해 생체 내에서 혈류 역학을 시각화하는 방법을 보여드렸습니다. 이것은 예를 들어 뇌졸중 후 혈류의 변화를 조사하기 위해 대뇌 피질 혈관 구조에서 대뇌 혈류 역학을 이미징하는 매우 강력한 방법입니다. BUL에서 형광 염료의 반복적인 꼬리 정맥 주사를 사용하여 다양한 시간에 다양한 상상을 할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때 가능한 가장 깨끗하고 멸균된 조건에서 작업하고 매우 안정적인 손을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 좋아요, 그게 다입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.