Usando uma pinça Laser Para Manipulação neurônios isolados In Vitro

Ashkin foi o primeiro a mostrar que pinças a laser ou armadilhas ópticas são uma ferramenta poderosa para manipular objetos vivos micronizados microscópicos. Neste vídeo, mostraremos como aplicamos essa tecnologia para capturar e mover neurônios. Esta é a estação de trabalho com pinças ópticas.

As setas verdes mostram o caminho percorrido pelo feixe de laser através da óptica do microscópio. Quando um feixe de laser focalizado pela lente objetiva do microscópio é refratado por uma célula. A força que muda a direção do raio de luz atua na célula, movendo-a em direção ao centro de foco.

Isso gera Pika Newton de força suficiente para puxar uma célula através do meio. Neste vídeo, falaremos sobre fabricação de pratos, preparação de células da retina, revestimento de células em pratos cultivados, manipulação de pinças a laser e observação do crescimento celular. Como as células aderem ao vidro, precisávamos criar uma área repelente de células onde as células pudessem ser facilmente presas com as pinças.

Metade do prato foi revestida com poly hema, um polímero repelente de células. A outra metade foi revestida com a célula um, um substrato que suporta o crescimento de nossas células. Primeiro, uma célula é identificada no lado adesivo da célula do prato.

Outra célula é então presa no lado do polímero e transportada para o lado adesivo, onde ambas as células estão emparelhadas. Para preparar pratos, usamos polystar esterilizado por sopro, pratos cultivados de 35 milímetros. Primeiro, cortamos um orifício de um centímetro na parte inferior com um pequeno torno ou uma furadeira.

Pegue óculos de cobertura limpos com ácido e coloque-os na vertical em um ambiente livre de poeira, como um exaustor. Pegue a solução de polietileno dissolvida em álcool a 95% e coloque algumas gotas perto do topo da tampa de vidro apenas na metade Deixe o poli hema secar. Marque o lado poli da tampa de vidro.

Coloque a proteção S ao redor do orifício no fundo do prato cultivado. Cole o vidro de cobertura no prato com proteção S. Certifique-se de que a poliamida esteja por dentro e também certifique-se de que não haja vazamentos nas aberturas da proteção da soleira.

Coloque a lamínula de forma que a borda da camada de poliéster desça pelo centro do prato. Deixe o prato secar por dois a três dias e, em seguida, raspe o fundo do prato com uma caneta de ponta de diamante com marcas, que servirão como pontos de referência para posicionar o prato no microscópio stage. Coloque a louça no capô e esterilize-a sob a luz ultravioleta.

Coloque uma ou duas gotas de solução de anticorpo anti-US de cabra no lado não poli do prato, tomando cuidado para não derramar sobre o revestimento polihêmico e deixe por cerca de três horas. Remova-o e lave com campainhas estéreis. Coloque a solução de anticorpos da célula um na mesma área e incube durante a noite, pronta para o experimento no dia seguinte.

As células em nosso laboratório são derivadas de retinas de salamandras da fase aquática adulta. As retinas são dissecadas e removidas, digeridas com enzimas. A placa cultivada pode então ser revestida com células isoladas.

Os olhos são removidos. A córnea é dissecada e removida. A ocular é colocada em toques estéreis.

A retina é separada da ocular retirando-a com a borda de uma pinça curva. O dióxido de carbono e o oxigênio são borbulhados em uma solução de campainha contendo propano e, em seguida, esterilizados através de um filtro ultrafino de 0,2 mícron. As retinas são colocadas na solução enzimática e digeridas por cerca de 40 minutos com agitação para quebrar o tecido.

Após lavagem três vezes, as retinas são dissociadas por tri. Usando uma pipeta de bola de três milímetros, as células isoladas estão prontas para o revestimento antes do revestimento. A placa cultivada contendo o meio é colocada no microscópio stage e orientada adequadamente usando as marcas de arranhões no fundo da placa.

Isso permite que a posição exata do prato seja duplicada no futuro. As células são então revestidas nos lados poli hema e célula um do prato. A posição da antena no microscópio platina, bem como a potência do laser, é controlada com o joystick.

Primeiro, identificamos uma célula aderida à célula de um lado do prato. Esta é uma célula multipolar da retina identificável por seus dendritos. As coordenadas da posição da célula são salvas.

Esta é uma célula fotorreceptora de bastonete no lado repelente de células polius do prato. O prato é abaixado e a célula é capturada pelo laser e levantada do fundo do prato. A célula agora está sendo transportada para o outro prato para as coordenadas da célula multipolar.

Na realidade, a célula é estacionária. É o prato que está se movendo. A célula agora está passando pela borda do revestimento poli hemo.

A protuberância que se estende da célula é o terminal do axônio. A célula está bem livre de quaisquer detritos e outras células no fundo do prato, que podem obstruir seu movimento. As imagens de desfocagem das células na parte inferior do prato são visíveis em segundo plano.

O bastonete chega à célula multipolar e pode ser posicionado com precisão no ponto e na distância desejados dessa célula. O prato é levantado e a célula adere ao substrato da célula um. As principais vantagens desse procedimento são que se pode escolher quais células mover e que as manipulações podem ocorrer em um experimento estéril fechado.

Interações célula a célula Pode ser monitorado com lapso de tempo de vídeo ou por fotografia digital. Pinças a laser podem ser usadas com qualquer técnica biológica Aqui, por exemplo, uma técnica de fluorescência demonstra a presença de proteínas sinápticas em pontos de conexão entre as células movidas pelas pinças.