Foto-inducido el entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) aplicada a los péptidos amiloidogénicas

Summary

Foto-inducido de entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) permite la caracterización de la distribución del tamaño de oligómero de mezclas de proteínas metaestable. Se demuestra la aplicación de picup a tres péptidos representante amiloidogénica los 40 – y 42-residuo forma de amiloide β-proteína, y la calcitonina, y un péptido de control de la hormona del crecimiento factor de liberación.

Abstract

El ensamblaje de las proteínas amiloidogénica en oligómeros tóxicos es un acontecimiento fundamental en la patogénesis de las enfermedades de mal plegamiento de proteínas, como el Alzheimer, el Parkinson y las enfermedades de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica hereditaria, y la diabetes tipo 2. Debido a la naturaleza metaestable de estos conjuntos de proteínas, es difícil evaluar su distribución de tamaño de oligómero cuantitativamente mediante los métodos clásicos, como la electroforesis, cromatografía de dispersión de la luz, fluorescencia, o dinámica. Oligómeros de proteínas amiloidogénica existen como mezclas metaestable, en el que los oligómeros se disocian en monómeros y asociarse en grandes asambleas de forma simultánea. Picup estabiliza la población oligómero por covalentes entrecruzamiento y cuando se combina con los métodos de fraccionamiento, como la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) o el tamaño de cromatografía de exclusión (SEC), ofrece picup instantáneas de la distribución de oligómeros de tamaño que existía antes de cruzar -linking. Por lo tanto, picup permite la visualización y el análisis cuantitativo de las poblaciones de proteínas metaestable y puede ser usado para monitorear el montaje y descifrar las relaciones entre las modificaciones de la secuencia y oligomerización¹. Mecánica, picup implica la foto-oxidación de Ru^{2 +} En un tris (bipiridilo) Ru (II) (RuBpy) a Ru^{3 +} Por irradiación con luz visible con la presencia de un aceptor de electrones. Ru^{3 +} Es un fuerte oxidante de un electrón capaz de abstraer un electrón de una molécula de proteína vecinos, generando una proteína radical^1,2. Los radicales son inestables y altamente reactivas y por lo tanto las especies desaparecen rápidamente a través de una variedad de reacciones intra e intermoleculares. Un radical puede utilizar la energía de un electrón no apareado para reaccionar con otro monómero proteína que forma un dímero radical, que posteriormente se pierde un átomo de hidrógeno y forma un estable, covalentemente ligado al dímero. El dímero puede reaccionar más a través de un mecanismo similar con monómeros o dímeros para formar oligómeros de orden superior. Ventajas de la relación picup a otros foto-químicos o métodos de entrecruzamiento^3,4 Son cortas (≤ 1 s) la exposición de controles no destructivos de luz visible, sin necesidad de<i> Pre facto</i> Modificación de la secuencia nativa, y de longitud cero covalentes de entrecruzamiento. Además, picup permite el entrecruzamiento de las proteínas dentro de pH y temperatura, incluyendo los parámetros fisiológicos. Este sentido, demuestran la aplicación de picup de entrecruzamiento de tres proteínas amiloidogénica los 40 – y 42-residuo de proteína amiloide β-variantes (Aβ40 y Aß42), y la calcitonina, y una proteína de control, la hormona del crecimiento factor liberador (GRF).

Protocol

1. Péptido de preparación Pesar ~ 100-200 mg de péptido liofilizado usando una microbalanza y la transferencia en la etiqueta, revestido con silicio, tubos de microcentrífuga de baja adsorbente. Aquí, nosotros usamos las secuencias humanas de Aβ40, Aß42, calcitonina y GRF. Aquí, nosotros usamos los péptidos pre-tratados con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obtener homogénea, global sin preparativos. Este paso es necesario porque preformados agregados inducir la agregación de …

Discussion

Picup fue desarrollado originalmente para estudiar complejos estables de proteínas ^2. El método fue aplicado más tarde para el estudio cuantitativo de las asambleas metaestable proteína amiloide, incluyendo Aß ^10, priones y las enfermedades asociadas a PrP ^{Sc 11,} y α-sinucleína ^12. Los factores más importantes que deben considerarse al diseñar un experimento picup son la estequiometría reactivo, tiempo de irradiación, y el procedimiento de preparación de la muestra. Las dos primeras cu…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp	기타	Dolan-Jenner Industries	Model 170-D	The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods.
35-mm SLR camera body	Tool	Pentax	SP500 model	In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source.
Clear, thin walled PCR tubes	기타	Eppendorf	951010006 supplied by Fisher L22-003-24
Glass vials (1.8 mL)	기타	Kimble Chromatography	60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60
GRF	Reagent	Bachem	H-3695
HFIP	Reagent	TCI America	H0424	Use in a fume hood.
Aβ40 and Aβ42	Reagent	UCLA Biopolymers Laboratory
Calcitonin	Reagent	American Peptide	22-1-10
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate	Reagent	Sigma	224758-1G	Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Ammonium persulfate	Reagent	Sigma	A-7460	Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
β-mercaptoethanol	Reagent	Sigma	M7154-25 ML	Can be used when SDS-PAGE analysis is performed.
Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x)	Reagent	Invitrogen	LC1676
XCell SureLock Mini-Cell	Tool	Invitrogen	EI0001
Novex Tricine Gels (10-20%)	기타	Invitrogen	EC6625B0X
Novex Tricine SDS Running Buffer (10x )		Invitrogen	LC1675
Silver Express Staining Kit		Invitrogen	LC6100