Microinjection d'ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.
Summary
La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d'ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.
Abstract
Un outil essentiel pour étudier le rôle d'un gène au cours du développement est la capacité à effectuer inactivation génique, surexpression, et des études misexpression. Dans le poisson zèbre (<em> Danio rerio</em>), La micro-injection d'ARN, d'ADN, protéines, oligonucléotides antisens et autres petites molécules dans l'embryon en développement fournit aux chercheurs un test rapide et robuste pour explorer la fonction des gènes<em> In vivo</em>. Dans cette vidéo, article, nous allons montrer comment préparer et microinject<em> In vitro</em> Synthétisé ARNm EGFP et un blocage de translation morpholino oligo contre<em> PKD2</em>, Un gène associé à rénale autosomique dominante polykystiques (PKRAD), dans une cellule embryons de poissons zèbres scène. Nous allons ensuite analyser le succès de l'ARNm et microinjections morpholino en vérifiant expression de la GFP et l'analyse du phénotype. De vastes applications de cette technique comprennent générer des animaux transgéniques et chimères germinales, des cellules sort de cartographie et de dépistage génétique. Ici, nous décrivons un protocole pour la surexpression de EGFP et knockdown des<em> PKD2</em> Par l'ARNm et l'injection d'oligonucléotides morpholino.
Protocol
Discussion
Microinjection dans des embryons de poisson zèbre est une technique bien établie et solide pour explorer le rôle d'un gène particulier dans le développement. Les applications incluent la surexpression, misexpression, et des dosages knockdown de votre gène d'intérêt ainsi que l'analyse épistatique entre les gènes multiples. Microinjection chez le poisson zèbre a été largement utilisé pour générer des animaux transgéniques, et la cartographie du destin cellulaire au début embryons blastula <s…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH et PKD Foundation pour ZS. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées en fonction de Yale Centre de Ressources animales (YARC) et institutionnel de protection des animaux et utilisation comité (IACUC) des lignes directrices.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
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