Mikroinjektion av mRNA och Morpholino oligonukleotider Antisens i Zebrafish embryon.
Summary
Mikroinjektion är en väletablerad och effektiv metod för att införa främmande ämnen i befruktade zebrafisk embryon. Här visar vi ett robust mikroinjektion teknik för att utföra mRNA överuttryck och morpholino oligonukleotid genen studier knockdown i zebrafisk.
Abstract
Ett viktigt verktyg för att undersöka rollen av en gen under utvecklingen är förmågan att utföra gen ÖVERVÄLDIGANDE, överuttryck, och studier misexpression. I zebrafisk (<em> Danio rerio</em>) Ger mikroinjektion av RNA, DNA, proteiner, oligonukleotider antisense och andra små molekyler i det växande embryot forskarna en snabb och robust test för att utforska genfunktion<em> In vivo</em>. I denna video-artikel kommer vi visa hur man kan förbereda och microinject<em> In vitro</em> Syntetiseras EGFP mRNA och en translationell-blockerande morpholino oligo mot<em> Pkd2</em>, En gen i samband med autosomal dominant polycystisk njursjukdom (ADPKD), i 1-cell zebrafisk skede embryon. Vi kommer då att analysera framgången med mRNA och morpholino microinjections genom att verifiera GFP uttryck och fenotyp analys. Bred tillämpningar av denna teknik inkluderar genererar transgena djur och groddar-line chimärer, cell-öde kartläggning och gen screening. Häri beskriver vi ett protokoll för överuttryck av EGFP och ÖVERVÄLDIGANDE av<em> Pkd2</em> Av mRNA och morpholino oligonukleotid injektion.
Protocol
Discussion
Mikroinjektion i zebrafisk embryon är en väl etablerad och robust teknik för att utforska rollen av en viss gen i utvecklingen. Applikationer inkluderar överuttryck, misexpression och analyser ÖVERVÄLDIGANDE av dina gener av intresse samt epistatisk analys mellan flera gener. Mikroinjektion i zebrafisk har i stor utsträckning använts för att generera transgena djur, och kartlägga cell öde i början blastula embryon 5,6,7,8,9. Dessutom fungerar tillämpningen av denna teknik som ett viktigt steg i a…
Acknowledgements
Arbetet stöddes av NIH och PKD Foundation för att ZS. Alla djurförsök har utförts enligt Yale Animal Resources Center (YARC) och Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
References
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
