Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.
Abstract
Geliştirme sırasında bir genin rolünün araştırılması için gerekli bir araç gen demonte, aşırı ekspresyonu ve misexpression çalışmalar gerçekleştirmek için yeteneğidir. Zebrafish yılında (<em> Danio rerio</em>), Gelişmekte olan embriyonun içine RNA, DNA, proteinler, antisens oligonükleotidler ve diğer küçük moleküller mikroenjeksiyon araştırmacılar gen fonksiyonu keşfetmek için hızlı ve sağlam bir çalışma sağlar<em> In vivo</em>. Bu video makalede, biz nasıl hazırlamak ve microinject gösterecektir<em> In vitro</em> Sentezlenmiş EGFP mRNA ve translasyon engelleme morfolino oligo karşı<em> Pkd2</em> 1-hücre sahne zebrafish embriyolara otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı (bireylerinde) ile ilgili bir gen. Daha sonra, GFP ifade ve fenotip analizi doğrulayarak mRNA ve morfolino microinjections başarısı analiz edecektir. Bu tekniğin geniş uygulama transgenik hayvanlar ve germ-line kimeralar üreten hücre kaderi haritalama ve gen taraması içerir. Bu yazıda tarif EGFP ve demonte aşırı ekspresyonu için bir protokol<em> Pkd2</em> MRNA ve morfolino oligonükleotid enjeksiyon.
Protocol
Bölüm 1: mikropipetler hazırlanması ve mikroenjeksiyon odası plakalar Isıtma ve borosilikat cam kapiller tüplerin (Dünya Precision Instruments, Inc, 1B100-4) çekerek bir mikropipet çektirmenin cihazı (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown P-97) mikropipetler imal. Az miktarda kil veya yapışkan bant üstünde bir Petri kabındaki saklayın. (Zebra balığı Kitap "ta anlatıldığı gibi), enjeksiyon sırasında embriyoların tutmak için kolay bir yöntem olarak hizmet v…
Discussion
Zebrafish embriyolar içine mikroenjeksiyon gelişimi belirli bir genin rol keşfetmek için köklü ve sağlam bir tekniktir. Uygulamalar ilgi yanı sıra birden fazla genin arasındaki epistatik analizi gen aşırı ekspresyonu, misexpression ve demonte deneyleri içerir. Transgenik hayvanlar oluşturma ve erken blastula embriyolar 5,6,7,8,9 hücre kaderi haritalama zebrafish içinde Mikroenjeksiyon yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, bu tekniğin uygulama hücre nakli yöntemleri 10</su…
Acknowledgements
Bu çalışma, ZS, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve PKD vakıf tarafından desteklenmiştir. Yale Hayvan Kaynakları Merkezi (YARC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) yönergeleri doğrultusunda tüm hayvan deneyleri yapılmıştır.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
1x E3 Medium
Reagent
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO2
0.1% Methylene blue
Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.. J. Vis. Exp. (27), e1113, doi:10.3791/1113 (2009).