Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos
Summary
En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).
Abstract
Mapeo óptico de la superficie cardíaca con sensibles al voltaje tintes fluorescentes se ha convertido en una herramienta importante para investigar la excitación eléctrica en modelos experimentales que van en escala de cultivos de células de órganos de todo el<sup> [1, 2]</sup>. El estado actual de la técnica de los sistemas de formación de imágenes ópticas, la generación y propagación de potenciales de acción en el ritmo cardíaco normal o en toda la iniciación y el mantenimiento de las arritmias se pueden visualizar casi al instante<sup> [1]</sup>. El último disponible en el mercado de sistemas pueden proporcionar información a las resoluciones espacio-temporal muy alta y se basa en la costumbre-construido el equipo inicialmente desarrollado para superar los obstáculos impuestos por los métodos electrofisiológicos más convencionales<sup> [1]</sup>. Los avances en alta resolución y alta velocidad complementary metal-oxide-semiconductor cámaras (CMOS) y la intensidad de brillo, diodos emisores de luz (LED), así como los tintes sensibles al voltaje, la óptica y filtros han empezado a hacer la adquisición de señales eléctricas prácticas para los biólogos celulares cardiovasculares que están más acostumbrados a trabajar con los microscopios. A pesar de la nueva generación de cámaras CMOS pueden adquirir 10.000 fotogramas por segundo en una matriz de píxeles 16.384, dependiendo del tipo de preparación de muestras, establecidas desde hace tiempo tecnologías de adquisición de fluorescencia, tales como arrays de fotodiodos, los sistemas de escaneo láser, y se enfría acusados-Coupled Device (CCD cámaras) todavía tienen algunas ventajas con respecto al rango dinámico, relación señal-ruido y la eficiencia cuántica<sup> [1, 3]</sup>. En el presente estudio, los corazones de ratas Lewis fueron perfundidos<em> Ex vivo</em> Con una perfusión de cristaloides (solución de Krebs-Henseleit) a 37 ° C en un aparato Langendorff modificada. Después de un período de estabilización de 20 minutos, los corazones fueron perfundidos de forma intermitente con 11 mmol / L 2,3-butanodiona monoxima para eliminar la contracción asociada al movimiento durante la adquisición de la imagen. De mapeo óptico, cargamos los corazones con la sonda potenciométrica de respuesta rápida di-8-ANEPPS<sup> [4]</sup> (5 mmol / L) y brevemente iluminada la preparación con 475 ± 15 nm de luz de excitación. Durante un típico período de 2 segundos de la iluminación,> 605 nm de luz emitida desde la preparación cardiaca fue fotografiada con una cámara CMOS de alta velocidad conectado a un macroscopio horizontal. Para esta demostración, los corazones estaban ritmo de 300 pulsaciones por minuto con un electrodo coaxial conectado a una unidad de estimulación eléctrica aislada. Simultánea los registros bipolares electrográficos fueron adquiridos y analizados junto con las señales de voltaje utilizando el software fácilmente disponible. De esta manera, los potenciales de acción en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos puede ser visualizado y registrado con las señales electroencefalográficas.
Protocol
Discussion
La extracción del corazón de ratas anestesiadas debe realizarse rápidamente para evitar la isquemia miocárdica. Si la perfusión de la isquemia o insuficiencia coronaria se produce, el corazón es probable que desarrollar arritmias y puede llegar a ser del infarto. Además, estos corazones se muestran insuficientes emisión de fluorescencia de las grabaciones de información y los análisis posteriores. Antes de cargar el medio de contraste, las células del miocardio deben ser adecuadamente preservados con solució…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (HL068915; HL088206) y las contribuciones al Fondo de conducción cardiaca en el Hospital de Niños de Boston.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock, Rochester, NY 14624 USA | FF505-SDi01-25×36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma, St. Louis, MO 63132 USA | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd Inc., Iowa 51601 USA | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma, St. Louis, MO 63132 USA | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA | D-3167 |
References
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- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
