Optisk Kartläggning av Langendorff-perfusion Rat Hearts
Summary
Den här artikeln beskriver en hög tidsmässiga och geografiska teknik för att optiskt bild aktionspotential rörelse på ytan av Langendorff-perfusion råtta hjärtan med hjälp av en potentiometrisk färgämne (di-8-ANEPPS).
Abstract
Optisk kartläggning av hjärtats yta med spänningskänsliga fluorescerande färger har blivit ett viktigt verktyg för att undersöka elektrisk excitation i experimentella modeller som varierar i skala från cellodlingar till hel-organ<sup> [1, 2]</sup>. Använda state-of-the-art optiska bildsystem, generering och spridning av aktionspotentialer under normal hjärtrytm eller hela initiering och underhåll av arytmier kan visualiseras nästan omedelbart<sup> [1]</sup>. Den senaste kommersiellt tillgängliga system kan ge information vid mycket höga Spatiotemporal resolutioner och baserades på specialbyggda utrustningen ursprungligen utvecklats för att övervinna de hinder som följer av mer konventionella elektrofysiologiska metoder<sup> [1]</sup>. Framsteg i hög upplösning och hög hastighet kompletterande metall-oxid-halvledar (CMOS) kameror och intensivt-ljus, lysdioder (LED) samt spänningskänsliga färgämnen, optik och filter har börjat göra elektrisk signal förvärv praktiskt för hjärt-cell biologer som är mer vana vid att arbeta med mikroskop. Även den senaste generationen av CMOS-kameror kan få 10 tusen bilder per sekund på en 16.384 pixel array, beroende på vilken typ av provberedning, sedan länge etablerade fluorescens förvärvet tekniker som fotodiod arrayer, laserscanning system och kyls Charge Coupled enhet (CCD ) kameror har fortfarande några tydliga fördelar med avseende på dynamiska omfånget, signal-brus-förhållande, och kvanteffektivitet<sup> [1, 3]</sup>. I den aktuella studien, var Lewis råtta hjärtan perfusion<em> Ex vivo</em> Med en kristalloid perfusat (Krebs-Henseleit lösning) vid 37 ° C på en modifierad Langendorff apparat. Efter en 20 minuters stabiliseringsperiod var hjärtan intermittent perfusion med 11 mmol / l 2,3-butanedione monoxime att eliminera kontraktion-associerad rörelse under bildtagning. För optiska kartläggning, lastade vi hjärtan med den snabba respons potentiometrisk sond di-8-ANEPPS<sup> [4]</sup> (5 mikromol / l) och kort upplysta beredning med 475 ± 15 nm excitation ljus. Under en typisk 2 andra period belysning, var> 605 nm ljus som avges från hjärtats preparatet avbildade med en höghastighets-CMOS-kamera ansluten till en horisontell makroskop. För denna demonstration var hjärtan tempo på 300 slag per minut med en koaxial elektrod kopplad till en isolerad elektrisk stimulering enhet. Samtidig bipolär electrographic inspelningar förvärvades och analyserats tillsammans med den spänning signaler med hjälp av lätt-tillgänglig programvara. På detta sätt kan aktionspotentialer på ytan av Langendorff-perfusion råtta hjärtan visualiseras och registrerade hos electrographic signaler.
Protocol
Discussion
Avlägsnandet av hjärta från bedövas råttor måste utföras snabbt för att undvika myokardischemi. Om ischemi eller otillräcklig koronar genomblödning inträffar kommer hjärtat att utveckla sannolikt arytmier och kan bli infarktområdet. Dessutom kommer dessa hjärtan visar otillräcklig fluorescens utsläpp för informativ inspelningar och efterföljande analyser. Innan du laddar färgen, hjärtmuskelceller behöver adekvat perfusion med Krebs-Henseleit lösning för att skapa och upprätthålla en fysiologisk …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av forskningsanslag från National Institutes of Health (HL068915, HL088206) och bidrag till hjärtöverledning fonden vid barnsjukhuset Boston.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock, Rochester, NY 14624 USA | FF505-SDi01-25×36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma, St. Louis, MO 63132 USA | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd Inc., Iowa 51601 USA | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma, St. Louis, MO 63132 USA | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
