Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

요약

우리는 총 내부 반사와 epifluorescence 현미경을 사용하여 교양 astrocytes에 막 및 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 측정하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

두뇌는 glial 세포가 포함되어 있습니다. Astrocytes, glial 세포의 종류는 긴 뉴런에 수동 지원 역할을 제공하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 증가 증거 astrocytes도 적극적으로 뉴런과 기능적 상호 작용을 통해 뇌의 기능에 참여할 수있다하는 것이 좋습니다. 그러나, astrocyte 생물학의 많은 근본적인 측면 논쟁, 불분명 및 / 또는 실험적으로 미개척 남아있다. 중요한 문제는 astrocytes의 세포내 칼슘 과도의 역학입니다. 칼슘이 잘 중요한 두번째 메신저로 설립되고 있기 때문에 그것이 astrocyte 칼슘 고도가 astrocytes에서 송신기의 릴리스를 실행할 수있는 제안 되었기 때문에이 적합합니다. 그러나, astrocytes의 신호 근처 플라즈마 막 칼슘의 자세한 설명을하거나 만족이되지 않았습니다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 살 세포의 플라즈마 막의 약 100 nm의 시간 생리학 관련 신호 이벤트를 분석하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 TIRF 현미경을 사용하여 거의 동시에 플라즈마 막과 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법의 자세한 상세하고 체계적인 응용 프로그램은 astrocyte 칼슘 신호의 정확한 세부 사항에 대해 알리기 위해 가능성이 있습니다. astrocyte 칼슘 역학에 대한 상세한 이해, 어떻게 언제 왜 astrocytes와 뉴런은 칼슘 의존 기능 상호 작용을 거쳐, 이해하는 기초를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

실험 절차

실험 절차는 다음 단계 현명한 방식으로 설명하는 두 가지 핵심 부분으로 구성됩니다.

1 부 : 준비 HIPPOCAMPAL ASTROCYTE 문화

간단히 혼합 hippocampal astrocyte - 신경 세포의 문화가 잘 설립 프로토콜 ^1,2,3을 사용하여 준비되었습니다. 우리는 건강 교양 astrocytes를 얻을 수있는 절차를 최적화. 아래에 나열된 모든 절차는 이러한 층류 후드로 멸균 환경에서 수행되어야합니다.

준비 coverslips

• 22mm의 coverslips (VWR, 48380-068)
• 폴리 - D - 라이신 (PDL, 시그마 P0899), aliquots (1 MG / ML)
• Laminin aliquots가 (20 μg / ML) : 1 MG / ML laminin 솔루션 (시그마 L2020)에 멸균 물의 49 ML을 추가, -20 ° C에서 1.2 ML aliquots 및 저장을

1. (50 μg / ML) 멸균 물의 PDL을 ....

토론

그것은 astrocytes은 세포 내 칼슘의 고도를 표시 잘 설정됩니다. 이들은 자발적으로 발생하는가의 연결 활동이나 astrocyte 표면 ¹¹ 수용체를 활성화하기 위해 agonists의 응용 프로그램에 의해 실행하실 수 있습니다. 하나의 중요한 논쟁 문제는 astrocyte 세포 내 칼슘의 고도는 뉴런 ^{11, 12} 수용체를 활성화 신호 분자의 릴리스를 실행할 수 있는지 여부입니다. 로 헤이든 ^{7, 13, 11} 맥카시 ^실험실에 의해 리뷰에 강조이보기와에 대한 증거를이 되었기 때문에 이것은 논쟁이다. 우리는 새로운 가설을 기반 실험 방법 astrocytes 충격 뉴런에게 ¹⁴ 결정할 수 있도록 설계하기 전에 astrocyte 칼슘 역학보다 정확한 이해가 필요하다는 주장 최근 뇌의 슬라이스 이미징 및 전기 생리학 데이터를 기반으로. 이 동영상이 문서에서 우리는 플라즈마 막과 교양 astrocytes 거의 동시에 글로벌 세포내 칼슘의 변화 근처 이미지에 간단한 방법을 제.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
VWR® 마이크로 커버슬립, 원형, No. 1	도구	VWR international	48380-068
Poly-D-lysine hydrobromide	시약	Sigma-Aldrich	P0899
Engelbreth-Holm-Swarm 생쥐 육종 기저막 유래 Laminin	시약	Sigma-Aldrich	L2020
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), 액상	시약	Invitrogen	14155-063
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), 액상 (Earle’s 염을 포함하며 L-glutamine 또는 phenol red는 포함하지 않음)	시약	Invitrogen	51200-038
Penicillin-Streptomycin 액상	시약	Invitrogen	15140-122
Sodium pyruvate 용액	시약	Sigma-Aldrich	S8636
HEPES 용액 1 M	시약	Sigma-Aldrich	H0887
N-2 Supplement (100X), 액상	시약	Invitrogen	17502-048
Horse Serum, 열불활성화	시약	Invitrogen	26050-088
PAPAIN-022	시약	Worthington Biochemical	LK003178
Neurobasal™ Medium (1X) 액상, Phenol Red 미포함	시약	Invitrogen	12348-017
B-27 Serum-Free Supplement (50X), 액상	시약	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), 액상	시약	Invitrogen	25030-149
셀 스트레이너	도구	BD Biosciences	352350
BD Falcon 멀티웰 평저 플레이트 및 덮개, 멸균	도구	BD Biosciences	353046
NaCl	시약	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	시약	Sigma-Aldrich	P3911
CaCl2 hexahydrate	시약	Sigma-Aldrich	21108
MgCl2 hexahydrate	시약	Sigma-Aldrich	M2670
HEPES free acid	시약	Sigma-Aldrich	H3375
D-(+)-glucose	시약	Sigma-Aldrich	G7528
Fluo-4, AM 1 mM DMSO 용액	시약	Invitrogen	F-14217
Pluronic® F-127 20% DMSO 용액	시약	Invitrogen	P-3000MP
Immersion Oil TYPE DF	현미경	Cargill Labs	16242
25 mm 원형 커버슬립용 오픈 챔버, 100 μl 용량	도구	Warner Instruments	64-0362 (RC-21BDW)
Series 20 챔버용 P-2 플랫폼, 비가열식	도구	Warner Instruments	64-0278 (P-2)
FluoSpheres 카복실기 수식 마이크로스피어, 0.1 μm, 황녹색 형광 (505/515) 2% 고형분	시약	Invitrogen	F8803