Cette procédure montre la purification et l'expansion in vitro des cellules CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T du sang périphérique entier et leur visualisation en utilisant des tétramères CMH de classe II. Tétramères permettent la visualisation directe des cellules T avec une spécificité antigénique unique et défini CMH de classe II restriction.
Complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T par cytométrie en flux. Cette méthode repose sur l'interaction entre le peptide hautement spécifique chargée du CMH et les correspondants récepteur des cellules T. Alors que l'affinité d'un seul CMH / peptide molécule est faible, la réticulation des complexes CMH / peptide avec la streptavidine augmente l'avidité de l'interaction, permettant leur utilisation comme réactifs coloration. En raison de la fréquence relativement faible des lymphocytes T CD4 + (~ 1 300 000 en une seule spécificité) ce test utilise une étape de l'amplification in vitro d'augmenter son seuil de détection. Des cellules mononucléaires sont purifiés à partir du sang périphérique par la sous-couche de Ficoll. Cellules CD4 + sont ensuite séparés par une sélection négative utilisant un cocktail d'anticorps biotinylé et d'anti-biotine billes magnétiques. En utilisant des cellules adhérentes de la fraction de cellules CD4 que cellules présentatrices d'antigènes, cellules T CD4 + sont développées dans les médias par l'ajout d'un peptide antigénique et de l'IL-2. Les cellules sont colorées avec élargi correspondant de classe II tétramère en incubant à 37 ° C pendant une heure et ensuite colorées à l'aide d'anticorps de surface tels que l'anti-CD4, anti-CD3 et anti-CD25. Après marquage, les cellules peuvent être directement analysées par cytométrie en flux. Les cellules positives tétramère se forment généralement une population distincte parmi les CD4 + cellules élargi. Cellules tétramère positifs sont généralement CD25 + CD4 et souvent élevé. Parce que le niveau de coloration tétramère de fond peut varier, les résultats coloration positive doit toujours être comparée à la coloration des cellules mêmes avec un tétramère pertinent. Multiples variantes de ce test de base sont possibles. Cellules tétramère positifs peuvent être triées pour l'analyse phénotypique d'autres, l'inclusion dans ELISPOT ou de tests de prolifération, ou d'autres épreuves du secondaire. Plusieurs groupes ont également démontré la co-marquage utilisant des tétramères et soit anti-cytokine et anti-FoxP3 anticorps.
Comprendre le rôle des cellules T CD4 + dans l'immunité est fondamentalement important. Toutefois, CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T peut être difficile à détecter et d'isoler à l'aide des méthodes traditionnelles. En revanche, CMH de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules T CD4 + à la spécificité de l'antigène désiré. Cette vidéo montre l'isolement, la purification et l'amplification in vitro des cellules T CD4 + et leur visualisa…
Nous remercions Dick Foley et Leigh Kimball pour leur rôle clé dans le tournage et la production vidéo.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Forma | 1200 | Or equivalent |
50 mL conical Tube | equipment | VWR | 47747-182 | Or equivalent |
1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | HyClone | SH30028.02 | Or equivalent |
Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
Pipet Aid XP | equipment | Drummond | 4-000-101 | Or equivalent |
10 mL pipet | equipment | Corning/Costar | CLS4492 | Or equivalent |
Aerosolve Canisters | equipment | Beckman | 359481 | with 50 mL inserts |
Centrifuge | equipment | Beckman | GS-6R | Or equivalent |
Transfer pipets | equipment | Samco | 202-20S | Or equivalent |
Pasteur pipets | equipment | VWR | 14672-200 | Or equivalent |
Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
Trypan blue | Reagent | Sigma | T6146 | 0.2% in PBS |
Hemocytometer | equipment | VWR | 15170-208 | |
15 mL conical tube | equipment | VWR | 05-527-90 | Or equivalent |
Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon | 352063 | |
RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalgene | 595-3320 | Or equivalent |
48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo Scientific | MCO-18AIC | Or equivalent |
20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
5 mL FACS tube | equipment | Falcon | 352008 | Polystyrene |
Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
Anti-CD3 | Reagent | BD pharmingen | 347344 | Or equivalent |
Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |