هذا الإجراء يدل على تنقية والتوسع في المختبر من خلايا CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية من الدم المحيطي كله والتصور وذلك باستخدام MHC tetramers الطبقة الثانية Tetramers تسمح التصور المباشر للخلايا T مع خصوصية واحدة ومحددة مستضد MHC تقييد الدرجة الثانية.
Abstract
معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) من الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لمستضد معين CD4 + الخلايا التائية التي التدفق الخلوي. هذا الأسلوب يعتمد على التفاعل بين الببتيد محددة للغاية ومحملة MHC المقابلة مستقبلات الخلايا تي. في حين أن تقارب من جزيء MHC / الببتيد واحدة منخفضة ، عبر ربط مجمعات MHC / الببتيد مع streptavidin يزيد الطمع من التفاعل ، مما يتيح استخدامها في تلوين الكواشف. بسبب الترددات المنخفضة نسبيا من خلايا CD4 + T (~ 1 في 300000 لخصوصية واحدة) هذا الاختبار يستخدم لتضخيم المختبر في خطوة لزيادة عتبة الخمسين من الكشف. وتنقيته من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى التي تقوم عليها Ficoll. ثم يتم فصل خلايا CD4 + عن طريق الانتقاء السلبي باستخدام biotinylated كوكتيل الأجسام المضادة والمعادية للالبيوتين المسمى الخرز المغناطيسي. استخدام خلايا ملتصق من الكسر خلايا CD4 كما مستضد تقديم الخلايا ، CD4 + T يتم توسيع الخلايا في وسائل الإعلام عن طريق إضافة الببتيد مستضدي وايل – 2. هي ملطخة الخلايا موسعة مع tetramer الدرجة الثانية المقابلة التي يحتضنها عند 37 مئوية لمدة ساعة واحدة وملون في وقت لاحق باستخدام الأجسام المضادة السطحية مثل CD4 المضادة ، ومكافحة CD3 ، ومكافحة CD25. بعد وضع العلامات ، ويمكن تحليل الخلايا مباشرة من التدفق الخلوي. الخلايا tetramer شكل إيجابي عادة سكانية متميزة بين CD4 + توسيع الخلايا. خلايا Tetramer ايجابية وعادة ما تكون CD25 + CD4 ، وارتفاع في أغلب الأحيان. لأن مستوى تلطيخ tetramer الخلفية يمكن أن تختلف ، ينبغي دائما أن تكون النتائج ايجابية تلطيخ مقارنة تلطيخ الخلايا نفسها مع tetramer غير ذي صلة. اختلافات متعددة من هذا الاختبار الأساسية ممكنة. ويمكن فرز الخلايا Tetramer إيجابية لمزيد من التحليل المظهري ، أو إدراجها في ELISPOT المقايسات انتشار الأسلحة النووية ، أو فحوصات ثانوية أخرى. وقد أثبتت عدة مجموعات كما شارك في تلطيخ tetramers به وإما لمكافحة خلوى أو أضداد FoxP3.
Protocol
1. الدم الطرفية وحيدة النواة الخلية (PBMC) العزلة الحصول على عينة من الدم — وينبغي جمع الدم في المحاقن أو أنابيب الدم والمضادة للمتخثر مع الهيبارين (1:50 نسبة) لمنع تخثر الدم. توقع محصول بلغ نحو 1 × 10 6 PBMC لكل مليلتر من ا?…
Discussion
فهم دور خلايا CD4 + T في الحصانة من المهم بشكل أساسي. ومع ذلك ، يمكن CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية يكون من الصعب اكتشاف وعزل باستخدام الطرق التقليدية. في المقابل ، MHC الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لخلايا CD4 + T مع خصوصية المستضد المطلوب. هذا الفيديو يدل على العز…
Acknowledgements
نشكر ديك فولي وكيمبال لي لدورهم الرئيسي في تصوير وإنتاج أشرطة الفيديو.
James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers. J. Vis. Exp. (25), e1167, doi:10.3791/1167 (2009).