यह प्रक्रिया शुद्धि को दर्शाता है और विशिष्ट प्रतिजन सीडी 4 + पूरी परिधीय रक्त और उनके दृश्य का उपयोग कर MHC वर्ग द्वितीय tetramers से टी कोशिकाओं की इन विट्रो विस्तार में. Tetramers एक एकल प्रतिजन विशिष्टता और परिभाषित MHC वर्ग द्वितीय प्रतिबंध के साथ टी कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट.
Abstract
प्रमुख उतक अनुरूपता परिसर (MHC) वर्ग द्वितीय tetramers विशिष्ट प्रतिजन CD4 के प्रत्यक्ष दृश्य + प्रवाह cytometry द्वारा टी कोशिकाओं की अनुमति देते हैं. इस विधि पेप्टाइड लोड MHC और इसी टी सेल रिसेप्टर के बीच अति विशिष्ट बातचीत पर निर्भर करता है. जबकि एक एक अणु / MHC पेप्टाइड की आत्मीयता कम है, पार से जोड़ने streptavidin साथ MHC / पेप्टाइड परिसरों बातचीत की उत्सुकता बढ़ अभिकर्मकों धुंधला के रूप में उनके उपयोग को सक्षम. सीडी 4 + टी कोशिकाओं (~ एक एक एकल विशिष्टता के लिए 300,000 में) की अपेक्षाकृत कम आवृत्तियों की वजह से इन विट्रो प्रवर्धन चरण में इस परख इस्तेमाल करने के लिए पता लगाने की दहलीज वृद्धि. Mononuclear कोशिकाओं परिधीय रक्त से Ficoll बुनियाद द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. सीडी 4 + कोशिकाओं तो नकारात्मक biotinylated एंटीबॉडी कॉकटेल और विरोधी – बायोटिन लेबल चुंबकीय मोतियों का उपयोग चयन के द्वारा अलग कर रहे हैं. अंश CD4 सेल से पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग के रूप में प्रतिजन कोशिकाओं, सीडी 4 + टी कोशिकाओं मीडिया में एक प्रतिजनी पेप्टाइड और आईएल -2 जोड़कर विस्तार कर रहे हैं पेश. विस्तार कोशिकाओं को इसी वर्ग द्वितीय tetramer के साथ एक घंटे के लिए 37 सी में incubating और बाद में दाग ऐसे विरोधी CD4, विरोधी CD3, और विरोधी CD25 के रूप में सतह एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग हैं. लेबलिंग के बाद, कोशिकाओं को सीधे प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया जा सकता है. tetramer सकारात्मक कोशिकाओं को आमतौर पर विस्तार + CD4 कोशिकाओं के बीच एक विशिष्ट जनसंख्या के रूप में. Tetramer सकारात्मक कोशिकाओं आम तौर पर कर रहे हैं CD25 + और अक्सर CD4 उच्च. क्योंकि पृष्ठभूमि tetramer धुंधला के स्तर पर भिन्न हो सकते हैं, सकारात्मक धुंधला परिणाम हमेशा एक अप्रासंगिक tetramer के साथ ही कोशिकाओं का धुंधला तुलना में किया जाना चाहिए. इस बुनियादी परख के एकाधिक बदलाव संभव हैं. Tetramer सकारात्मक कोशिकाओं आगे प्ररूपी विश्लेषण ELISPOT या प्रसार assays में शामिल, या अन्य माध्यमिक assays के लिए हल किया जा सकता है. कई समूहों को भी सह धुंधला tetramers और या तो साइटोकाइन विरोधी या विरोधी FoxP3 एंटीबॉडी का उपयोग कर दिखा दिया है.
Protocol
1. परिधीय रक्त mononuclear सेल अलगाव (PBMC) एक खून का नमूना प्राप्त करना – सीरिंज या रक्त नलियों में रक्त एकत्र किया जाना चाहिए और विरोधी हेपरिन (01:50 अनुपात) के साथ coagulated थक्के रोकने के लिए. के बारे में 1 × रक्त के एमएल …
Discussion
प्रतिरक्षा में की भूमिका सीडी 4 + टी कोशिकाओं को समझना मौलिक महत्वपूर्ण है. हालांकि, विशिष्ट प्रतिजन सीडी 4 + टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए और पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर अलग करना मुश्किल हो सकता है. इसक?…
Acknowledgements
हम फिल्म और वीडियो उत्पादन में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए डिक Foley और Leigh Kimball धन्यवाद.
James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers. J. Vis. Exp. (25), e1167, doi:10.3791/1167 (2009).