CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

Summary

Questa procedura dimostra la purificazione e l'espansione in vitro di cellule CD4 + antigene specifico le cellule T del sangue periferico da tutto e la loro visualizzazione utilizzando tetrameri MHC di classe II. Tetrameri consentire la visualizzazione diretta delle cellule T con una singola specificità antigenica e definito MHC di classe II restrizione.

Abstract

Complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II tetrameri consentire la visualizzazione diretta dei CD4 + antigene specifico le cellule T mediante citometria di flusso. Questo metodo si basa sulla interazione altamente specifica tra peptide caricato MHC e il corrispondente delle cellule T del recettore. Mentre l'affinità di un singolo MHC / peptide molecola è bassa, il cross-linking complessi MHC / peptide con streptavidina aumenta l'avidità di interazione, consentendo il loro impiego come reagenti di colorazione. A causa delle frequenze relativamente basso di cellule CD4 + T (~ 1 in 300.000 per una specificità unica) questo saggio si avvale di una fase di amplificazione in vitro di aumentare la soglia di rilevazione. Cellule mononucleate sono purificati dal sangue periferico da sottofondo Ficoll. Cellule CD4 + sono poi separati da selezione negativa utilizzando cocktail biotinilato anticorpi e perle di anticorpi anti-biotina magnetico. Utilizzando cellule aderenti dalla frazione di cellule CD4 come cellule presentanti l'antigene, cellule T CD4 + sono espanse in media con l'aggiunta di un peptide antigenico e IL-2. Le cellule espanse sono colorati con la corrispondente classe II tetramero di incubazione a 37 ° C per un'ora e successivamente colorati con anticorpi di superficie come anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Dopo l'etichettatura, le cellule possono essere analizzati direttamente mediante citometria di flusso. Le cellule tetramero positivo tipicamente formano una popolazione distinta tra le cellule CD4 + espanse. Cellule tetramero positivi sono di solito CD25 + CD4 e spesso elevata. Perché il livello di colorazione di fondo tetramero possono variare, risultati colorazione positiva deve essere sempre rispetto alla colorazione delle stesse cellule con un tetramero irrilevante. Più varianti di questo test di base sono possibili. Cellule tetramero positivi possono essere ordinati per ulteriori analisi fenotipica, l'inclusione in ELISPOT o saggi di proliferazione, o altre prove secondarie. Diversi gruppi hanno anche dimostrato di co-colorazione con tetrameri e uno anti-citochine o anti-FoxP3 anticorpi.

Protocol

1. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) isolamento Ottenere un campione di sangue – sangue deve essere raccolti in siringhe o provette di sangue e anti-coagulato con eparina (1:50 ratio) per prevenire la coagulazione. Aspettatevi una resa di circa 1 × 10 6 PBMC per ml di sangue – circa il 40% dei quali sarà CD4 positivi (CD4 +) le cellule T. Aliquota del sangue in 50 mL coniche, 25 ml per provetta. Se il sangue si è separata, mescolare delicatamente prima aliquoting per di…

Discussion

Comprendere il ruolo delle cellule T CD4 + nel immunità è di fondamentale importanza. Tuttavia, CD4 + antigene specifico le cellule T possono essere difficili da individuare e isolare con metodi tradizionali. Al contrario, tetrameri MHC di classe II permette la visualizzazione diretta delle cellule T CD4 + con la specificità antigene desiderato. Questo video dimostra l'isolamento, la purificazione e l'amplificazione in vitro di cellule T CD4 + e la loro successiva visualizzazione con tetrameri. Classe II sono…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Forma	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	HyClone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning/Costar	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalgene	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo Scientific	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD pharmingen	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent