Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.
Complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II tetrâmeros permite a visualização direta do antígeno específico CD4 + células T por citometria de fluxo. Esse método se baseia na interação altamente específica entre peptídeo carregado MHC eo receptor de células T correspondente. Enquanto a afinidade de uma molécula MHC / peptídeo única é baixa, cross-linking complexos MHC / peptídeo com estreptavidina aumenta a avidez da interação, possibilitando a sua utilização como coloração reagentes. Por causa das freqüências relativamente baixas de células CD4 + T (~ 1 em 300.000 para uma especificidade única) este ensaio utiliza um passo de amplificação in vitro para aumentar o seu limiar de detecção. Células mononucleares são purificadas do sangue periférico por underlay Ficoll. CD4 + células são então separados por seleção negativa usando cocktail anticorpo biotinilado e anti-biotina marcada esferas magnéticas. Usando células aderentes a partir da fração de células CD4-células apresentadoras de antígenos como, células T CD4 + são expandidos em mídia pela adição de um peptídeo antigênico e IL-2. As células expandidas estão manchadas com o correspondente da classe II tetrâmero pela incubação a 37 C por uma hora e, posteriormente, coradas anticorpos de superfície, como anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Após a marcação, as células podem ser diretamente analisados por citometria de fluxo. As células positivas tetrâmero normalmente formam uma população distinta entre os CD4 + células expandidas. Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados. Porque o nível de coloração tetrâmero fundo pode variar, os resultados da coloração positiva deve ser sempre comparado com a coloração das células mesmo com um tetrâmero irrelevante. Múltiplas variações deste ensaio básicas são possíveis. Tetrâmero células positivas podem ser classificadas para a análise fenotípica ainda, a inclusão no ELISPOT ou ensaios de proliferação, ou outros ensaios secundários. Vários grupos também demonstraram co-coloração usando tetrâmeros e ou de citocinas anti-ou anti-FoxP3 anticorpos.
Compreensão do papel das células T CD4 + na imunidade é de fundamental importância. No entanto, CD4 + antígeno específico das células T pode ser difícil de detectar e isolar usando métodos tradicionais. Em contraste, tetrâmeros de MHC classe II permite a visualização direta de células CD4 + T com a especificidade do antígeno desejado. Este vídeo demonstra o isolamento, purificação e amplificação in vitro de células CD4 + T e sua visualização posterior usando tetrâmeros. Tetrâmeros de classe II s?…
Agradecemos a Dick Foley e Leigh Kimball para seus papéis-chave na filmagem e produção de vídeo.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Forma | 1200 | Or equivalent |
50 mL conical Tube | equipment | VWR | 47747-182 | Or equivalent |
1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | HyClone | SH30028.02 | Or equivalent |
Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
Pipet Aid XP | equipment | Drummond | 4-000-101 | Or equivalent |
10 mL pipet | equipment | Corning/Costar | CLS4492 | Or equivalent |
Aerosolve Canisters | equipment | Beckman | 359481 | with 50 mL inserts |
Centrifuge | equipment | Beckman | GS-6R | Or equivalent |
Transfer pipets | equipment | Samco | 202-20S | Or equivalent |
Pasteur pipets | equipment | VWR | 14672-200 | Or equivalent |
Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
Trypan blue | Reagent | Sigma | T6146 | 0.2% in PBS |
Hemocytometer | equipment | VWR | 15170-208 | |
15 mL conical tube | equipment | VWR | 05-527-90 | Or equivalent |
Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon | 352063 | |
RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalgene | 595-3320 | Or equivalent |
48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo Scientific | MCO-18AIC | Or equivalent |
20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
5 mL FACS tube | equipment | Falcon | 352008 | Polystyrene |
Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
Anti-CD3 | Reagent | BD pharmingen | 347344 | Or equivalent |
Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |