Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Summary

Este procedimiento muestra la purificación y la expansión in vitro de las células CD4 + antígeno específico de células T de sangre periférica y su visualización utilizando tetrámeros de MHC de clase II. Tetrámeros permitir la visualización directa de las células T con una especificidad de antígeno único y definido restricción MHC de clase II.

Abstract

Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II tetrámeros permite la visualización directa de las células CD4 + antígeno específico de células T por citometría de flujo. Este método se basa en la interacción altamente específica entre el péptido cargado MHC y el receptor de células T correspondientes. Mientras que la afinidad de un único MHC / péptido molécula es baja, el entrecruzamiento complejos MHC / péptido con estreptavidina aumenta la avidez de la interacción, lo que permite su uso como reactivos de coloración. Debido a las frecuencias relativamente bajo de células CD4 + T (~ 1 en 300.000 para una sola especificidad), este ensayo utiliza un paso de amplificación in vitro para aumentar su umbral de detección. Las células mononucleares se purifican a partir de sangre periférica por subyace Ficoll. Las células CD4 + se separan por selección negativa con un cóctel de anticuerpos con biotina y anti-biotina marcada partículas magnéticas. El uso de células adherentes de la fracción de células CD4 en las células presentadoras de antígeno, células T CD4 + se amplió en los medios de comunicación mediante la adición de un péptido antigénico e IL-2. Las células se expanden son manchadas con la correspondiente clase II tetrámero mediante la incubación a 37 ° C durante una hora y posteriormente teñidos con anticuerpos de superficie, tales como anti-CD4, anti-CD3 y anti-CD25. Después de etiquetado, las células pueden ser directamente analizadas por citometría de flujo. Las células tetrámero positivo generalmente se forman una población distinta entre los CD4 + células ampliado. Tetrámero células positivas suelen ser CD25 + y CD4 alta frecuencia. Debido a que el nivel de tinción de fondo tetrámero puede variar, los resultados positivos de tinción debe estar siempre en comparación con la tinción de las mismas células con un tetrámero irrelevante. Múltiples variaciones de este ensayo básicos son posibles. Tetrámero células positivas pueden ser clasificados para su posterior análisis fenotípico, la inclusión en ELISPOT o los ensayos de proliferación, u otras pruebas secundarias. Varios grupos han demostrado también co-tinción con tetrámeros y, o bien anti-citoquinas y anticuerpos anti-FoxP3.

Protocol

1. Sangre periférica de células mononucleares (PBMC) de aislamiento Obtener una muestra de sangre – la sangre deben ser recogidas en jeringas o tubos de sangre y anticoagulada con heparina (1:50 ratio) para prevenir la coagulación. Esperar un rendimiento de alrededor de 1 × 10 6 PBMC por ml de sangre – aproximadamente el 40% de los cuales se CD4 positivos (CD4 +) las células T. Alícuota de la sangre en tubos de 50 ml cónico de 25 ml por tubo. Si la sangre se ha separado, mezcle sua…

Discussion

Comprender el papel de las células CD4 + T en la inmunidad es de fundamental importancia. Sin embargo, CD4 + antígeno específico de células T puede ser difícil de detectar y aislar de manera artesanal. Por el contrario, tetrámeros de MHC de clase II permite la visualización directa de las células CD4 + T con el antígeno específico deseado. Este vídeo demuestra el aislamiento, purificación y amplificación in vitro de células T CD4 + y su posterior visualización utilizando tetrámeros. Tetrámeros Clase II …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Forma	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	HyClone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning/Costar	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalgene	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo Scientific	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD pharmingen	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent