Summary
चेचक संक्रमण और कोशिकाओं मेजबान और वायरल जीन की अभिव्यक्ति के HeLa के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल. भाग 3 fluorescently दोनों रंगों के अमीनो एलिल युग्मन द्वारा मेजबान वायरल नमूनों से परिलक्षित शाही सेना लेबलिंग की प्रक्रिया का वर्णन करता है. 3 के 3 भाग.
Abstract
परिवार
Protocol
भाग 1: ARNA लेबलिंग: रंगों के अमीनो एलिल युग्मन
- ARNA नमूने के 1μg 1.5mL microcentrifuge ट्यूबों में जोड़ें.
- जब तक वे पूरी तरह से सूख रहे हैं कम या कोई गर्मी पर नमूने सूखी वैक्यूम. प्रत्येक ट्यूब जैसे ही यह सूखा है कैप - overdry नहीं!
- प्रत्येक ट्यूब 9μl युग्मन बफर जोड़ें और 1 मिनट के लिए धीरे vortexing से ARNA resuspend. संक्षिप्त अपकेंद्रित्र ट्यूब के तल में नमूना इकट्ठा करने के लिए, और तब नमूना बर्फ पर बैठते हैं.
- Cy3 या Cy5 डाई के प्रत्येक ट्यूब 22μl उच्च गुणवत्ता DMSO जोड़ें. डाई की एक ट्यूब 2 नमूने के लिए पर्याप्त है. Cy3 डाई आपके संदर्भ के नमूने लेबलिंग के लिए है, और Cy5 डाई अपने परीक्षण के नमूने की लेबलिंग के लिए है.
- भंवर रंगों को अच्छी तरह से मिश्रण. अंधेरे में रंगों का उपयोग करने के लिए तैयार रखें जब तक. डाई के प्रयोग से पहले 1 घंटे से पहले तैयार नहीं है. सुनिश्चित करें कि कोई पानी / डाई DMSO के मिश्रण में किसी भी बिंदु पर हो जाता है.
- प्रत्येक नमूने के लिए तैयार डाई / DMSO Cy की 11μl जोड़ें. धीरे vortexing से अच्छी तरह मिक्स.
- कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के लिए सेते हैं. टिनफ़ोइल साथ नमूने को कवर करने या उन्हें एक दराज में रखने के लिए प्रकाश के लिए जोखिम को कम.
- ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक नमूने 4.5μl hydroxlyamine जोड़ने के लिए प्रतिक्रिया बुझाना. धीरे vortexing से अच्छी तरह मिक्स.
- कमरे के तापमान पर एक और 15 मिनट के लिए सेते हैं. टिनफ़ोइल साथ नमूने को कवर करने या उन्हें एक दराज में रखने के लिए प्रकाश के लिए जोखिम को कम.
भाग 2: लेबल ARNA सफाई
- भंवर शाही सेना बाध्यकारी मोती संक्षेप में उपयोग करने से पहले एक भी मिश्रण प्राप्त करने के लिए.
- ARNA बंधन मिक्स कमरे के तापमान पर तैयार करें. (तालिका 1)
- Vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स.
- कम से कम 10 मिनट के लिए एक 1.5mL और 50-60 ° सी में ट्यूब सेते में ARNA Elution बफर Aliquote.
- प्रत्येक नमूने ARNA बंधन मिश्रण के 70μl जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting 3-4 बार अच्छी तरह से मिश्रण.
- पीसीआर थाली से एक 96 अच्छी तरह से थाली दौर नीचे नमूने स्थानांतरण.
- 50μl 100% प्रत्येक नमूना के लिए isopropanol जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting 3-4 बार अच्छी तरह से मिश्रण.
- धीरे कम से कम 2 मिनट के लिए एक कक्षीय हिलनेवाला पर थाली मिलाने के लिए अच्छी तरह से नमूने मिश्रण.
- एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली ले जाएँ चुंबकीय मोतियों पर कब्जा. स्टैंड पर थाली छोड़ दो जब तक मिश्रण पारदर्शी हो जाता है और बाध्यकारी मोती pelleted है.
- ध्यान से एक वैक्यूम Aspirator के साथ चुंबकीय मोतियों को परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate. वैकल्पिक रूप से, ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटायें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. सतह पर तैरनेवाला या तो एक उज्ज्वल गुलाबी या इस अनिगमित डाई अणु कारण बिंदु पर एक चमकदार नीली होना चाहिए.
- चुंबकीय स्टेंड से थाली निकालें.
- प्रत्येक अच्छी तरह 100μl ARNA धो समाधान जोड़ें और कक्षीय हिलनेवाला पर मध्यम गति से 1 मिनट के लिए थाली हिला. मोती पूरी तरह से इस कदम पर नहीं फैलाने सकता है.
- एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली ले जाएँ चुंबकीय मोतियों पर कब्जा.
- ध्यान से एक वैक्यूम Aspirator के साथ चुंबकीय मोतियों को परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate. वैकल्पिक रूप से, ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटायें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- चुंबकीय स्टेंड से थाली निकालें.
- धोने 100μl ARNA धो समाधान के साथ एक 2 एन डी समय दोहराएँ.
- 2 एन डी धोने के बाद, कक्षीय हिलनेवाला पर 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर थाली झटकों से मोती सूखी . नमूने overdry मत करो!
- मोतियों से प्रत्येक नमूने के 20μl preheated ARNA Elution बफर जोड़कर ARNA Elute.
- सख्ती से हिला कक्षीय हिलनेवाला पर 3 मिनट के लिए थाली, तो जांच के लिए यकीन है कि चुंबकीय मोतियों को पूरी तरह बिखरे हैं. यदि नहीं, मिलाते जारी है.
- एक बार चुंबकीय मोतियों को पूरी तरह छितरी हुई है, एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली को स्थानांतरित करने के लिए चुंबकीय मोतियों पर कब्जा. सतह पर तैरनेवाला साफ, लेबल ARNA नमूने हैं, और या तो एक पीला गुलाबी या हल्के नीले रंग का होना चाहिए.
- ध्यान से एक नया पीसीआर प्लेट (या पीसीआर ट्यूबों) eluted ARNA हस्तांतरण.
- (वैकल्पिक कदम) एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर माइक्रोएरे मॉड्यूल का उपयोग 1.5μl को मापने के द्वारा शाही सेना और नमूने में डाई की राशि एकाग्रता की जाँच करें.
- तुरंत अपनी पसंद का एक माइक्रोएरे मंच पर लेबल ARNA संकरण, या वैकल्पिक रूप से, आप -80 में लेबल ARNA की दुकान कर सकते हैं डिग्री सेल्सियस जब तक आप संकरण के लिए तैयार हैं.
टेबल 1 ARNA बंधन मिक्स
| अभिकर्मक | 1 प्रतिक्रिया के लिए राशि |
| शाही सेना के बंधन * मोती | 10μl |
| मनका Resuspension समाधान * | 4μl |
| 100% isopropanol ** | 6μl |
| ARNA बंधन बफर ध्यान लगाओ | 50μl |
* शाही सेना के साथ बाध्यकारी मोती मिक्समनका resuspension पहली समाधान
** Isopropanol जोड़ें और ARNA बाध्यकारी बफर ध्यान केंद्रित जोड़ने से पहले अच्छी तरह से मिश्रण.
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Discussion
गंभीर कदम
जब एमिनो एलिल युग्मन प्रदर्शन, यह शीघ्र ही पहले युग्मन (कम से कम 1 घंटे) DMSO में डाई resuspend और यह सुनिश्चित करने के लिए पानी नहीं डाई / DMSO के मिश्रण में हो जाता है, के रूप में यह डाई पर सक्रिय समूह के साथ प्रतिक्रिया होगी के लिए महत्वपूर्ण है. आरएनए overdry (नीचे के बजाय 1 2uL पूरी तरह से सूखे में सूख कर सकते हैं हो), और युग्मन बफर में अच्छी तरह से resuspend मत करो. युग्मन प्रतिक्रिया के दौरान अंधेरे में प्रतिक्रिया रखने के लिए, सामयिक flicking के साथ और नीचे स्पिन अगर वांछित.
/ आवेदन महत्व
लेबल इस प्रोटोकॉल से परिणामस्वरूप आरएनए मानव, वायरल, या कस्टम प्रोटीन संकरित संस्कृति में संक्रमित कोशिकाओं के जीन की अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं का आकलन किया जा सकता है. माइक्रोएरे प्लेटफार्मों भिन्न है, तो लेबल जांच से संकरण मिश्रण की तैयारी के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
एक कस्टम डिजाइन poxvirus एक सरणी का उपयोग करना, हम सामान्य श्रेणियों में "जल्दी" या "देर" संकरण संकेत के समय पर आधारित है और चाहे या नहीं वायरल डीएनए प्रतिकृति प्रतिलेख पता लगाने के लिए आवश्यक किया गया था जीन वर्गीकृत कर रहे थे. हम प्रत्येक अस्थायी कक्षा में जीन की उम्मीद कार्यात्मक श्रेणियों (यानी, जल्दी, मध्यवर्ती और देर जीन की उम्मीद) प्रतिलेखन के सही समय के रूप में परिवर्तन मनाया.
इस काम में उपयोग तरीकों वायरस प्रतिकृति चक्र में जल्दी या देर लिखित जीन की भविष्यवाणी करने में सक्षम हैं, लेकिन एक जल्दी और देर प्रमोटर के साथ एक दोहरी / जल्दी देर प्रमोटर के साथ टेप के बाद जीन बनाम अधिक कठिनाई भेद केवल प्रारंभिक जारी रहती है और हो सकता है देर से समय पर पाया. इसके अलावा, देर वायरल जीनों के ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से चलाने के एक दिया / सरणी पर जांच मौके पर संकेत को प्रभावित है, सरणी के लिए hybridizing शाही सेना के रूप में नामित ओआरएफ या एक अपस्ट्रीम ओआरएफ से आया हो सकता है है हो सकता है. खपरैल का छत arrays के लिए इस समस्या को हल करने का प्रयास किया है, लेकिन चुनौतियों संकरण आधारित 2,3,4 दृष्टिकोण का उपयोग प्रतिलेखन के माध्यम से चलाने के पता लगाने में रहते हैं.
होस्ट transcriptional पैटर्न भी इन तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. हालांकि, चेचक तंत्र की एक किस्म encodes के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं रोकना, और मेजबान transcriptional प्रतिक्रियाओं अन्य 5,6,7,8 stimuli करने के लिए तुलना में कम हो सकता है . कई मेजबान बचाव में शामिल जीनों की अभिव्यक्ति के बाद संक्रमण के बाद बदल दिया है, इसलिए वायरल जीन है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया के योगदान को ध्यान में लिया जाना चाहिए.
इन तरीकों का उपयोग, सभी वायरल जीनों के transcriptional समय का एक नक्शा और पहचान किया जा सकता है अज्ञात वायरल जीनों के कार्यों को पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, इन तरीकों वायरस और मेजबान के बीच जटिल वार्ता टुकड़े करना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. इन विधियों अन्य मेजबान रोगज़नक़ संक्रमण सिस्टम को मोटे तौर पर लागू होते हैं. यदि ब्याज की रोगज़नक़ mRNAs polyadenylated नहीं करता है, वैकल्पिक तरीकों को सीधे कुल शाही सेना लेबल किया जा सकता है रैखिक प्रवर्धन के बिना. दोनों मेजबान और तुल्यकालिक संक्रमण के दौरान वायरस जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके, इन तरीकों हमें मेजबान सेलुलर के रूप में अच्छी तरह के रूप में वायरस के संक्रमण के खिलाफ मेजबान वातावरण काउंटर गढ़ के साथ वायरस बातचीत में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए अनुमति देते हैं.
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Acknowledgments
व्हाइटहेड संस्थान अध्येता फंड
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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