Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 3 descreve o processo de rotulagem fluorescente do RNA amplificado a partir do host e as amostras virais por acoplamento alílico amino de corantes. Parte 3 de 3.
Abstract
A família<em> Poxviridae</em> Consiste de DNA double-stranded grandes contendo vírus que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros da<em> Orthopox</em> Gênero incluem a varíola, o agente causador da varíola humana, macacos, e vaccinia (VAC), o membro protótipo da família de vírus. Dentro do relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, três classes de genes são codificados: precoce, intermediária e final. Enquanto todas as três classes são transcritos pela polimerase viral codificado RNA, cada classe tem uma função diferente no ciclo de vida do vírus. Poxvírus utilizar múltiplas estratégias para a modulação do ambiente celular do hospedeiro durante a infecção. A fim de compreender a regulação de ambos os host e expressão do gene do vírus, nós utilizamos genome-wide abordagens para analisar a abundância transcrição de ambos os vírus e células hospedeiras. Aqui, demonstramos infecções tempo de percurso de células HeLa com Vaccinia vírus RNA e amostragem em vários intervalos de tempo pós-infecção. Ambos os host e viral RNA total é isolado e amplificado para a hibridização de microarrays para a análise da expressão gênica.
Protocol
Parte 1: ARNA rotulagem: acoplamento alílico amino dos corantes Adicionar 1μg das amostras em tubos de microcentrífuga ARNA 1,5 ml. Vácuo seco as amostras em fogo baixo ou nenhum até que estejam completamente secos. Cap cada tubo assim que estiver seca – não overdry! Adicionar tampão de acoplamento 9μl a cada tubo e ressuspender o ARNA suavemente vórtex por 1 minuto. Centrifugar brevemente para coletar a amostra no fundo do tubo, e depois deixar a amostra sentar n…
Discussion
Passos crítica
Ao realizar o acoplamento amino alil, é fundamental para voltar a suspender o corante em DMSO em breve (menos de 1 hora) antes de acoplamento e garantir que não haja água fica na mistura de corante / DMSO, como ele vai reagir com o grupo ativo no corante. Não overdry o RNA (podem ser secas até 1-2uL ao invés de completamente seca), e ressuspender bem no buffer de acoplamento. Durante a reação de acoplamento, manter a reação no escuro, com flicking ocasionais e spin do…
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
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