بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 3 يصف عملية وضع العلامات fluorescently تضخيم الحمض النووي الريبي من كل من المضيف والعينات الفيروسية التي اقتران الآليل الأمينية من الأصباغ. الجزء 3 من 3.
Abstract
الأسرة<em> Poxviridae</em> تتكون من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الكبيرة التي تحتوي على الفيروسات التي تحاكي حصرا في السيتوبلازم من الخلايا المصابة. أعضاء<em> الجدري</em> جنس تتضمن الجدري ، والعامل المسبب للجدري الصغيرة الإنسان ، والقرود ، والوقس (VAC) ، وعضو من عائلة prototypic الفيروس. داخل الجينوم الوقس كبيرة نسبيا (~ 200 كيلوبايت) ، يتم ترميز ثلاثة أنواع من الجينات : في وقت مبكر ، وسيطة ، والمتأخر. بينما كتب جميع الطبقات الثلاث polymerases RNA فيروسي ترميز ، ولكل فئة يؤدي وظيفة مختلفة في دورة حياة الفيروس. Poxviruses استخدام استراتيجيات متعددة لتعديل البيئة المضيفة الخلوي أثناء العدوى. من أجل فهم كل من استضافة وتنظيم التعبير الجيني والفيروسات ، واستخدمت على نطاق ونحن الجينوم النهج لتحليل النص وفرة من كل الفيروسات والخلايا المضيفة. هنا ، علينا أن نظهر للالتهابات دوام خلايا هيلا مع فيروس الوقس وأخذ عينات الحمض النووي الريبي في الوقت عدة نقاط في مرحلة ما بعد الإصابة. يتم عزل كل من الحمض النووي الريبي مجموع المضيفة والفيروسية وتضخيم للتهجين لميكروأرس لتحليل التعبير الجيني.
Protocol
الجزء 1 : آرنا العلامات : الأمينية اقتران الآليل من الأصباغ إضافة 1μg من العينات آرنا في أنابيب microcentrifuge 1.5mL. فراغ تجفيف العينات في درجة حرارة منخفضة أو معدومة حتى تجف تماما. سقف كل أنبوب في أقر?…
Discussion
خطوات حاسمة
عند إجراء اقتران الأمينية الآليل ، فمن الأهمية بمكان أن resuspend الصبغة DMSO في فترة وجيزة (أقل من 1 ساعة) قبل توصيل المياه وضمان عدم وجود مزيج يحصل في صبغ / DMSO ، لأنها سوف تتفاعل مع مجموعة نشطة على صباغة. لا overdry الحمض النووي ال…
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3. J. Vis. Exp. (26), e1170, doi:10.3791/1170 (2009).