Summary
Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 3 descreve o processo de rotulagem fluorescente do RNA amplificado a partir do host e as amostras virais por acoplamento alílico amino de corantes. Parte 3 de 3.
Abstract
A família
Protocol
Parte 1: ARNA rotulagem: acoplamento alílico amino dos corantes
- Adicionar 1μg das amostras em tubos de microcentrífuga ARNA 1,5 ml.
- Vácuo seco as amostras em fogo baixo ou nenhum até que estejam completamente secos. Cap cada tubo assim que estiver seca - não overdry!
- Adicionar tampão de acoplamento 9μl a cada tubo e ressuspender o ARNA suavemente vórtex por 1 minuto. Centrifugar brevemente para coletar a amostra no fundo do tubo, e depois deixar a amostra sentar no gelo.
- Adicionar 22μl DMSO qualidade alta a cada tubo de Cy3 ou Cy5 corante. Um tubo de tinta é suficiente para duas amostras. O corante é Cy3 para a rotulagem suas amostras de referência, e os corantes Cy5 é para a rotulagem de amostras de teste.
- Vortex os corantes para misturar bem. Manter os corantes no escuro até que esteja pronto para uso. Não preparar tintura antes de 1 hora antes de usar. Verifique se não há água fica na mistura de corante / DMSO em qualquer ponto.
- Adicionar 11μl do corante DMSO / Cy preparados para cada amostra. Misture bem em vórtice suavemente.
- Incubar durante 30-45 minutos em temperatura ambiente. Cobrir as amostras com papel alumínio ou mantê-los em uma gaveta para minimizar a exposição à luz.
- Após a incubação, adicionar 4.5μl hydroxlyamine a cada amostra para saciar a reação. Misture bem em vórtice suavemente.
- Incubar por mais 15 minutos em temperatura ambiente. Cobrir as amostras com papel alumínio ou mantê-los em uma gaveta para minimizar a exposição à luz.
Parte 2: rotuladas ARNA clean-up
- Vortex as contas RNA ligação rapidamente para obter uma mistura mesmo antes do uso.
- Preparar a mistura ARNA Binding à temperatura ambiente. (Tabela 1)
- Misture bem em vórtice.
- Aliquote o tampão de eluição ARNA em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos.
- Adicionar 70μl da mistura ARNA vinculativo para cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
- Transferência das amostras da placa de PCR para uma placa de 96 poços de fundo redondo.
- Adicionar 50μl de isopropanol 100% a cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
- Agitar suavemente a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos para misturar as amostras.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixar a placa no stand até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. O sobrenadante deve ser um brilhante rosa ou um azul brilhante neste momento devido à moléculas de corante não incorporado.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Adicionar 100μl de solução de lavagem ARNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não pode se dispersar totalmente nesta etapa.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Repita a lavagem de cada vez 2 º com 100μl de solução de lavagem ARNA.
- Após a lavagem 2 º, seca as contas agitando a placa por 1 minuto no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry as amostras!
- Eluir a ARNA dos grânulos adicionando 20μl tampão de eluição ARNA pré-aquecido para cada amostra.
- Agitar vigorosamente a placa no agitador orbital por 3 minutos, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer.
- Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. O sobrenadante contém a limpo, amostras ARNA rotulados, e deve ser uma pálida cor de rosa ou um azul pálido.
- Transferir cuidadosamente o ARNA eluída a uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR).
- (Passo opcional) Verificar a concentração de RNA e da quantidade de corante nas amostras medindo 1.5μl em um espectrofotômetro NanoDrop usando o módulo Microarray.
- Imediatamente hibridizar o ARNA rotulados em uma plataforma de microarray de sua escolha ou, alternativamente, você pode armazenar o ARNA rotulados a -80 ° C até que esteja pronto para a hibridização.
Tabela 1 Mix ARNA Binding
| Reagente | Montante para uma reação |
| Beads RNA Binding * | 10μl |
| Bead * Solução ressuspensão | 4μl |
| Isopropanol 100% ** | 6μl |
| ARNA Concentrado de tampão de ligação | 50μl |
* Mix as contas de ligação com a RNAtalão solução ressuspensão primeiro
** Adicione o isopropanol e misturar bem antes de adicionar o ARNA concentrado de tampão de ligação.
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Discussion
Passos crítica
Ao realizar o acoplamento amino alil, é fundamental para voltar a suspender o corante em DMSO em breve (menos de 1 hora) antes de acoplamento e garantir que não haja água fica na mistura de corante / DMSO, como ele vai reagir com o grupo ativo no corante. Não overdry o RNA (podem ser secas até 1-2uL ao invés de completamente seca), e ressuspender bem no buffer de acoplamento. Durante a reação de acoplamento, manter a reação no escuro, com flicking ocasionais e spin down, se desejar.
Application / Significado
O RNA marcado resultantes deste protocolo pode ser hibridizado com humanos, microarrays viral, ou o costume de avaliar as respostas de expressão gênica de células infectadas em cultura. Plataformas microarray variam, por isso siga as instruções do fabricante para a preparação de mistura de hibridização da sonda marcada.
Usando uma matriz poxvírus personalizados 1, fomos capazes de classificar os genes nas categorias geral de "precoce" ou "atrasado" com base no tempo do sinal de hibridização e se ou não a replicação do DNA viral foi necessária para a detecção de transcrição. Observamos as categorias funcionais de genes esperados em cada classe temporal (ou seja, espera genes precoce, intermediária e tardia) a variação quanto ao momento exato de transcrição.
Os métodos utilizados neste trabalho são capazes de prever genes transcritos vírus cedo ou mais tarde no ciclo de replicação, mas têm mais dificuldade em distinguir início somente contra genes com um promotor precoce e tardia desde transcrições com um promotor cedo / tarde dupla pode persistir e ser detectada, por vezes, tarde. Além disso, run-through transcrição de genes virais tarde podem afetar sinal em um determinado teste / ponto na matriz, como a hibridação RNA para a matriz pode ter vindo da ORF designado ou uma ORF upstream. Arrays azulejos têm tentado resolver este problema, no entanto os desafios permanecem na detecção de executar através de transcrição usando abordagens baseadas hibridização 2,3,4.
Padrões anfitrião transcricional também pode ser avaliada através destes métodos. No entanto, vaccinia codifica uma variedade de mecanismos para inibir as respostas de acolhimento, e resposta do hospedeiro transcricional pode ser diminuída em comparação a outros estímulos 5,6,7,8. Uma vez que a expressão de muitos genes envolvidos na defesa do hospedeiro é alterada após a infecção, a contribuição de genes virais que neutralizam as respostas imune do hospedeiro deve ser levado em consideração.
Utilizando estes métodos, um mapa do tempo de transcrição de todos os genes virais podem ser identificadas e usadas para interrogar funções de genes desconhecidos viral. Além disso, estes métodos podem ser utilizados para dissecar o diálogo intrincado entre o vírus e hospedeiro. Estes métodos são amplamente aplicáveis a outros sistemas de acolhimento patógeno-infecção. Se o patógeno de interesse não tem polyadenylated mRNAs, métodos alternativos podem ser usados diretamente para rotular o RNA total, sem amplificação linear. Ao analisar o anfitrião e expressão de genes de vírus durante a infecção síncrona, estes métodos permitem-nos para obter insights sobre a interação do vírus com o ambiente celular do hospedeiro, assim como anfitrião contra-defesas contra infecção por vírus.
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Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Fundos
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
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