Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 3
Summary
Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux. Partie 3 décrit le processus d'étiquetage de l'ARN par fluorescence amplifié à partir de l'hôte et des échantillons viraux par le couplage d'allyle aminés de colorants.
Abstract
La famille<em> Poxviridae</em> Se compose de grandes double-brin d'ADN contenant des virus qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de la<em> Orthopoxvirus</em> Genre comprennent la variole, l'agent causal de la variole humaine, simienne, et la vaccine (ACC), le membre prototypique de la famille des virus. Dans le génome relativement importante (~ 200 ko) de la vaccine, trois classes de gènes sont encodés: précoce, intermédiaire et tardive. Alors que tous les trois classes sont transcrits par les ARN polymérases virale codée, chaque classe a une fonction différente dans le cycle de vie du virus. Les poxvirus utilisent de multiples stratégies pour la modulation de l'environnement cellulaire de l'hôte pendant l'infection. Afin de comprendre la régulation de l'hôte et l'expression des gènes du virus, nous avons utilisé l'échelle du génome des approches pour analyser l'abondance transcription de deux virus et les cellules hôtes. Ici, nous démontrons infections cours du temps des cellules HeLa par le virus de la vaccine et de l'ARN d'échantillonnage à différents moments après l'infection. Les deux hôtes et virales ARN total est isolé et amplifié pour que l'hybridation des puces pour l'analyse de l'expression génique.
Protocol
Discussion
Étapes critiques
Lorsque vous effectuez le couplage aminé allyle, il est essentiel de remettre en suspension le colorant dans le DMSO sous peu (moins de 1 heure) avant l'accouplement et s'assurer eau ne pénètre pas dans le mélange colorant / DMSO, comme il va réagir avec le groupe actif sur le colorant. Ne pas trop sécher l'ARN (peut être séché à 1-2UL plutôt que complètement à sec), et remettre ainsi dans le tampon de couplage. Pendant la réaction de couplage, garde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows Fonds
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | 기타 | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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