使用IVIS频谱的乳腺肿瘤在体内生物发光成像

Summary

在小鼠乳腺肿瘤细胞表达荧光素酶植入皮下和可视化使用光学成像监测肿瘤的生长和发展非侵入性的一项纵向研究。

Abstract

4T1小鼠乳腺肿瘤细胞可以植入NU / nu小鼠分cutaneously在15至20天可扪及肿瘤形成。这种移植瘤模型系统是有价值的，公认的抗肿瘤化合物的体内评价临床前研究。

经过精心设计，4T1细胞系表达萤火虫荧光素酶基因（luc2）。当携带4T1 – luc2肿瘤的小鼠注射荧光素的肿瘤发出可见光的信号，可以使用像一个敏感的光学成像系统IVIS频谱监测。从肿瘤的光子通量，发光细胞的数量成正比，可测的信号监测肿瘤的生长和发展。 IVIS校准，使发光信号和纵向研究的绝对定量，不影响定量结果的情况下，可以在许多个月及以上的信号幅度的几个订单执行。

肿瘤的生长，可以监视通过生物发光，数天前，肿瘤的大小变得扪或通过传统的物理手段衡量。这种快速的监测可以提供了解肿瘤发展的早期事件，或导致更短的实验程序。

因缺氧或药物治疗的肿瘤细胞死亡和坏死表示，早在减少发光信号。这种细胞死亡的可能不是由一个物理手段测量肿瘤大小减少陪同。能够看到肿瘤坏死的早期事件，对治疗药物的选择和发展产生重大影响。

肿瘤生长的定量成像使用IVIS提供了精确的定量分析和加速实验过程中产生的结果。

Protocol

一个荧光素酶表达的肿瘤细胞株的种类繁多，可用于临床前研究在小鼠模型。 这些细胞是作为无病原体的冷冻文化，这将很容易在标准的媒体没有必要为选择标记增长。 我们的实验中，我们将使用4T1 – luc2小鼠乳腺肿瘤细胞株，表达的荧光素酶基因， 体内的基因表达或tumorgenesis光学指标。我们将使用荧光素酶表达跟踪原发肿瘤的非侵入性的生长，但它们也可以被用来定位和监控转移性病灶。 荧光素酶活性，注射前，为了做到这一点，必须验证，90％融合瓶中是由胰蛋白酶消化收获，然后计算。 50,000个单元格，然后在一个微孔板和系列稀释的单井配发执行。荧光素被添加到每毫升150ug井和孵育2分钟。微孔板可成像IVIS或发光板的读者，以确定表达水平。该细胞系表达到6500光子每秒每个细胞，但任何高于500光子每秒每个细胞中的表达水平，可以成功地在体内成像。 现在，我们有最佳活性的细胞，我们可以进行皮下注射的一步。 为了促进肿瘤的最佳检测，我们使用的是一个无胸腺免疫功能低下的裸小鼠品系。注射前，动物麻醉深麻醉效果。 下一步，我们将注资25细胞在100ul PBS皮下注射到侧面。负载细胞在1 ml注射器及附加26号针头。轻轻提起皮肤，用血管钳，使一个“帐篷”，并在该基地的注入细胞。新注入的细胞可以立即成像。在每个成像会议上的荧光素，每公斤体重150毫克，然后通过两个进入腹膜腔注射给药。 在这项研究中，动物成像荧光素注射后10分钟，以确保一致的光子通量。我们会告诉你在下一步骤。荧光素动力学可以从每天的不同。在这个特殊的模式，测量荧光素注射后10分钟了15％的变异范围内的结果。 我们的实验中，我们将使用在活体成像系统IVIS频谱使用一回稀释电荷耦合设备冷却到-90 ° C至达到最高灵敏度。为了支持绝对定量，系统的措施，在停机时间暗负责，并在初始化过程中运行自校准。要启动成像，初始化IVIS系统（一次点击），并设置实验成像参数。 选择成像的动物数量领域。在使用积分麻醉流形的工具，可以保持最多5个动物。该阶段是在一个恒定的37 ° C，以保持动物体温。一个心电图端口提供监测动物的健康，在紧张的程序。 在生活图像软件，曝光时间，光圈和像素的分级可以优化的基础上的细胞株的表达水平。在一项实验中，而不会影响定量结果随时可以改变这些设置。 IVIS获得了白光下一个定量的发光或荧光信号，这是在图像上叠加的动物摄影图像。 表示每秒光子发光信号强度图显示。图像显示调整，以提供最佳的对比度和图像分辨率不影响定量。 从细胞发光，可以测量在注射使用的地区利益的工具的网站。测量数据显示在表格连同有关的图像采集，可以保存或出口进行分析所有的实验参数可以采集多个图像，覆盖秒或数月，根据实验性质的纵向研究比较。我们将在零时间光子通量测量肿瘤和4周的监测每隔双周成像。 从肿瘤的光子通量表达荧光素酶，使生物发光与肿瘤的大小直接相关的活细胞的数量成正比。 肿瘤术后5天尚未情溢于言表，但细胞可通过生物发光和肿瘤都被看作是积极成长的量化。在这个阶段，生物发光信号stronge河可以调整，使图像清晰，相机不饱和的曝光时间，光圈和像素binning。 IVIS自动补偿，使这些测量，可以比较早，后来在实验中收集的光收集的变化。 7天，术后肿瘤是第一次和生物发光测量已经产生了7天的数据的情溢于言表。 在植入后28天，肿瘤坏死和细胞开始死亡。估计卡尺测量肿瘤的大小，没有明显的变化，但将减少从肿瘤发光，表明细胞死亡。 卡尺测量，生物发光测量可以继续，直到达到一个人性化的端点。肿瘤坏死因缺氧或治疗制度将减少生物发光表示，即使他们不减少的肿块。