स्तन IVIS स्पेक्ट्रम का उपयोग ट्यूमर के vivo bioluminescent इमेजिंग में

Summary

स्तन ट्यूमर कोशिकाओं luciferase व्यक्त subcutaneously चूहों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं और कल्पना का उपयोग करने के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग ट्यूमर और गैर invasively एक अनुदैर्ध्य अध्ययन में वृद्धि और विकास पर नजर रखने के.

Abstract

4T1 माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं परमाणु / परमाणु चूहों में उप cutaneously प्रत्यारोपित करने के लिए 15 से 20 दिनों में स्पर्शनीय ट्यूमर फार्म कर सकते हैं. इस xenograft ट्यूमर मॉडल प्रणाली ख्यात अर्बुदरोधी यौगिकों के vivo मूल्यांकन में पूर्व नैदानिक ​​के लिए मूल्यवान है .

4T1 सेल लाइन constitutively जुगनू luciferase जीन (luc2) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर है. जब 4T1 – luc2 ट्यूमर ले चूहों Luciferin ट्यूमर फेंकना एक दृश्य प्रकाश संकेत है कि IVIS स्पेक्ट्रम की तरह एक संवेदनशील ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग पर नजर रखी जा सकता है इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं. ट्यूमर से फोटॉन प्रवाह प्रकाश उत्सर्जक कोशिकाओं की संख्या के लिए आनुपातिक है और संकेत करने के लिए ट्यूमर के विकास और विकास पर नजर रखने के लिए मापा जा सकता है है. IVIS bioluminescent संकेत और अनुदैर्ध्य अध्ययन के पूर्ण quantitation मात्रात्मक परिणाम समझौता किए बिना कई महीनों से अधिक और संकेत परिमाण के कई आदेशों पर किया जा सकता है के लिए सक्षम करने के लिए calibrated है.

ट्यूमर के विकास को कई दिनों के लिए bioluminescence द्वारा नजर रखी जा सकता है ट्यूमर के आकार से पहले स्पर्शनीय या पारंपरिक शारीरिक माध्यम से औसत दर्जे का हो जाता है. यह तेजी से निगरानी ट्यूमर के विकास में प्रारंभिक घटनाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए या छोटे प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

ट्यूमर कोशिका मृत्यु और hypoxia या नशीली दवाओं के उपचार के कारण परिगलन जल्दी bioluminescent संकेत में कमी से संकेत दिया है. यह कोशिका मृत्यु ट्यूमर के आकार में कमी के रूप में भौतिक माध्यम से मापा द्वारा नहीं किया जा के साथ हो सकता है. ट्यूमर परिगलन में प्रारंभिक घटनाओं को देखने की क्षमता और चिकित्सीय एजेंट के चयन और विकास पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है.

ट्यूमर के विकास की मात्रात्मक इमेजिंग IVIS का उपयोग सटीक quantitation प्रदान करता है और प्रयोगात्मक प्रक्रिया accelerates परिणाम उत्पन्न.

Protocol

Luciferase व्यक्त कैंसर कोशिका लाइनों की एक विस्तृत विविधता के माउस मॉडल में पूर्व नैदानिक ​​अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन कोशिकाओं को एक रोगज़नक़ मुक्त जमे हुए संस्कृति, जो आसानी से चयन मार्करों के लिए कोई ज़रूरत नहीं के साथ मानक मीडिया में विकसित होगा के रूप में प्रदान की जाती हैं. हमारे प्रयोग के लिए, हम 4T1 luc2 murine स्तन ट्यूमर कोशिका लाइन, जो luciferase जीन है कि जीन की अभिव्यक्ति या vivo में tumorgenesis का एक ऑप्टिकल संकेत के रूप में कार्य करता है व्यक्त इस्तेमाल करेंगे . हम luciferase अभिव्यक्ति का उपयोग प्राथमिक गैर invasively ट्यूमर के विकास को ट्रैक करने के लिए होगा, लेकिन वे यह भी पता लगाने और metastatic घावों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Luciferase गतिविधि इंजेक्शन से पहले, और आदेश में यह करने के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए, एक 90% मिला हुआ फ्लास्क trypsinization द्वारा काटा जाता है और तब गिना. 50,000 कोशिकाओं तो एक microtiter प्लेट और धारावाहिक dilutions की एक अच्छी तरह से एक में तिरस्कृत कर रहे हैं प्रदर्शन कर रहे हैं. Luciferin मिलीलीटर प्रति 150ug में कुओं को जोड़ा जाता है और 2 मिनट के लिए incubated. microplate IVIS या एक luminescent प्लेट पाठक करने के लिए अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण में imaged किया जा सकता है. यह सेल लाइन दूसरी प्रति सेल प्रति 6500 फोटॉनों व्यक्त किया, लेकिन दूसरी प्रति सेल प्रति 500 ​​फोटॉनों से ऊपर किसी भी अभिव्यक्ति के स्तर vivo में सफलतापूर्वक imaged कर सकते हैं. अब है कि हम इष्टतम गतिविधि की कोशिकाओं है, हम उपचर्म इंजेक्शन कदम के लिए कार्रवाई कर सकते हैं. आदेश में ट्यूमर का इष्टतम पता लगाने की सुविधा के लिए, हम एक athymic immunocompromised नग्न माउस तनाव का उपयोग कर रहे हैं. इंजेक्शन से पहले, पशुओं के लिए संज्ञाहरण के लिए गहरे प्रभाव anesthetized हैं. अगला हम 100ul पीबीएस में 250,000 कोशिकाओं को इंजेक्षन जाएगा subcutaneously दिशा में अंतःक्षिप्त रहे हैं. 1 मिलीलीटर सिरिंज में लोड कोशिकाओं और एक 26 गेज सुई देते हैं. त्वचा धीरे लिफ्ट के साथ संदंश एक "तम्बू" बनाने के लिए और आधार पर कोशिकाओं इंजेक्षन. नव इंजेक्शन कोशिकाओं तुरंत imaged किया जा सकता है. प्रत्येक इमेजिंग सत्र में प्रति किलोग्राम शरीर के वजन Luciferin के 150mg की कुल तो peritoneal गुहा में दो इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित किया जाता है. इस अध्ययन में, जानवरों Luciferin इंजेक्शन के बाद 10 मिनट imaged लगातार फोटॉन प्रवाह सुनिश्चित. हम आप अगले कदम में यह दिखाता हूँ. Luciferin कैनेटीक्स दिन से दिन के लिए भिन्न हो सकते हैं. इस विशेष मॉडल में, Luciferin इंजेक्शन के बाद 10 मिनट मापने 15% परिवर्तनशीलता के एक सीमा के भीतर परिणाम दे दी. हमारे प्रयोग के लिए हम vivo इमेजिंग प्रणाली में IVIS स्पेक्ट्रम का उपयोग वापस thinned प्रभारी युग्मित डिवाइस -90 ठंडा करने के लिए डिग्री सेल्सियस अधिकतम संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए का उपयोग करता हूँ. निरपेक्ष quantitation का समर्थन करने के लिए, सिस्टम नीचे समय के दौरान अंधेरे प्रभारी उपायों और आरंभीकरण के दौरान एक आत्म अंशांकन चलाता है. शुरू इमेजिंग, IVIS सिस्टम इनिशियलाइज़ (एक क्लिक करें) और प्रयोग के लिए इमेजिंग मानकों सेट. जा रहा है imaged पशुओं की संख्या के लिए देखने के क्षेत्र का चयन करें. ऊपर 5 पशुओं अभिन्न संवेदनाहारी कई गुना का उपयोग कर साधन में बनाए रखा जा सकता है. चरण निरंतर 37 डिग्री पशुओं में शरीर का तापमान बनाए रखने के सी. एक ईकेजी बंदरगाह तनावपूर्ण प्रक्रिया के दौरान पशुओं के स्वास्थ्य की निगरानी करने के लिए प्रदान की जाती है. छवि सॉफ्टवेयर, जोखिम समय, च – रोक और पिक्सेल के रहने binning सेल लाइन की अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है. इन सेटिंग्स को एक प्रयोग के दौरान किसी भी समय मात्रात्मक परिणाम को प्रभावित किए बिना बदला जा सकता है. IVIS सफेद रोशनी और एक मात्रात्मक bioluminescent या फ्लोरोसेंट संकेत है, जो छवि पर overlaid है के तहत जानवरों का एक फ़ोटो छवि प्राप्त है. bioluminescent संकेत प्रति सेकंड photons में व्यक्त किया है और एक तीव्रता नक्शे के रूप में प्रदर्शित. छवि प्रदर्शित करने के लिए quantitation को प्रभावित किए बिना इष्टतम और छवि के विपरीत संकल्प उपलब्ध कराने के लिए निकाला जाता है. कोशिकाओं से luminescence ब्याज उपकरण के एक क्षेत्र का उपयोग इंजेक्शन की साइट पर मापा जा सकता है है. मापन डेटा तालिका में प्रदर्शित कर रहे हैं एक साथ सभी प्रयोगात्मक छवि पर कब्जा है जो या बचाया जा सकता है और विश्लेषण के लिए निर्यात से संबंधित मानकों के साथ एकाधिक छवियों और प्राप्त किया जा सकता है अनुदैर्ध्य अध्ययन सेकंड महीने या प्रयोग की प्रकृति के आधार पर कवर में तुलना. हम बार शून्य पर ट्यूमर से फोटॉन प्रवाह और उपाय करेंगे द्वि – साप्ताहिक अंतराल पर इमेजिंग के साथ 4 हफ्तों के लिए निगरानी. ट्यूमर से फोटॉन प्रवाह रहते हैं तो bioluminescence ट्यूमर के आकार के साथ सीधे संबद्ध luciferase व्यक्त कोशिकाओं की संख्या के लिए आनुपातिक है. 5 दिनों के बाद आरोपण कम ट्यूमर अभी तक स्पर्शनीय नहीं है, लेकिन कोशिकाओं bioluminescence और ट्यूमर को सक्रिय रूप से बढ़ देखा जा रहा है के माध्यम से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है. इस अवस्था में bioluminescence संकेत बहुत stronge हैआर जोखिम समय, च – रोक और पिक्सेल binning ताकि छवि स्पष्ट है और कैमरा तर नहीं करता समायोजित किया जा सकता है. IVIS स्वचालित रूप से प्रकाश संग्रह में परिवर्तन के लिए compensates तो इन मापों पहले और बाद में प्रयोग में एकत्र लोगों की तुलना में किया जा सकता है. 7 दिनों पोस्ट आरोपण ट्यूमर माप पहले से ही डेटा के 7 दिनों के उत्पन्न किया है पहली बार और bioluminescence के लिए स्पर्शनीय हैं. 28 दिनों के बाद आरोपण से कम, ट्यूमर परिगलित होते जा रहे हैं और कोशिकाओं को मरने के लिए शुरू. ट्यूमर कैलीपर माप द्वारा अनुमानित आकार बदलने के appreciably नहीं करता, लेकिन ट्यूमर से luminescence कोशिका मृत्यु का संकेत कम हो जाएगा. कैलिपर माप और bioluminescence माप जब तक मानवीय endpoint तक पहुँच जाता है जारी किया जा सकता है. ट्यूमर परिगलन hypoxia या उपचार शासनों के कारण कम bioluminescence द्वारा दर्शाया जाएगा, भले ही वे ट्यूमर जन कम नहीं.