Summary
После нейронных формирование трубки, нейроэпителия сужает и складок в то время как трубка наполняется эмбриональной цереброспинальной жидкости (eCSF) с образованием эмбриональных желудочков мозга. Мы разработали эту технику инъекции желудочка лучше визуализировать заполненных жидкостью пространство в отличие от нейроэпителиальных формы в живой эмбрион.
Abstract
Правильное формирование желудочка мозга в процессе эмбрионального развития мозга необходимы для нормальной функции мозга. Желудочки мозга хорошо сохранились и полости внутри мозга, которые заполнены спинномозговой жидкости. В данио, после нейронных формирование трубки, нейроэпителия претерпевает ряд перетяжек и складок в то время как он наполняется жидкостью в результате чего мозг формирование желудочка. Для того чтобы понять процесс желудочка формирования и нейроэпителиальных меняет свою форму, которые происходят в то же время, нам нужно способ визуализации желудочка пространства по сравнению с мозговой ткани. Тем не менее, характер прозрачных эмбрионах данио делает его трудно отличить от ткани желудочка пространства. Поэтому мы разработали инъекцию желудочков мозга техники, где желудочка пространство заполнено флуоресцентным красителем и изображено светлое и люминесцентной микроскопии. Светлое и флуоресцентные изображения затем обрабатывается и накладывается в Photoshop. Этот метод позволяет для визуализации желудочка пространство с флуоресцентным красителем, по сравнению с формой нейроэпителия в образе светлого. Мозг желудочка инъекций в данио рерио могут быть использованы с 18 часа после оплодотворения до начала личиночной стадии. Мы использовали этот метод широко в наших исследованиях мозга формирование желудочка и морфогенеза, а также для характеристики мозга морфогенеза мутантов (1-3).
Protocol
Протокол
Часть 1: Подготовка к микроинъекции
- Подготовка к инъекции, потянув капиллярных игл использованием Саттер инструменты игла съемника.
- Заполните игла с флуоресцентной краской (такие как Техас-красный Декстран).
- Горы иголку в аппарате микроманипулятора и микроинъекции.
- Вырезать иглу соответствующего размера под углом для создания скошенных чаевые.
- Измерьте размер капли и убедитесь, что он находится между 1-2nl на инъекцию в масле.
Часть 2: Подготовка эмбрионов
- Inject эмбрионов 30 минут раньше, чем этап интерес. Например, для исследования желудочков через 24 часа после оплодотворения (HPF), ввести эмбрионов на 23,5 HPF. Этап эмбрионов в соответствии с Киммел и соавт. (4).
- Под стереомикроскопа, осторожно удалите хориона с использованием эмбрионов щипцами.
- Использование пластиковых блюдо покрытием с 1% агарозы, ткнуть отверстия в агарозном с пластиковыми 1-200 мкл кончика пипетки. Осторожно снимите агарозном заглушки из отверстий использованием щипцов.
- Трансфер эмбрионов в зачаточном состоянии СМИ в блюдо агарозы с отверстиями.
- Добавить tricaine (производится в соответствии с Уэстерфилд (5)) к СМИ, чтобы обезболить эмбрионов и предотвратить смещение во время эксперимента.
- Аккуратно эмбриона хвостом вниз в дыру, и ориентируем его так, что инъекции аппарата находится на задней стороне эмбриона.
Часть 3: Потребители инъекционных желудочков мозга
- Чтобы придать желудочков мозга, организовать микроманипуляция установки так, чтобы кончик иглы находится в том же поле зрения, как эмбрион на высокой мощности.
- Осторожно введите иглу через тонкие roofplate заднего мозга только сзади r0/r1 hingepoint, не поражая ткани мозга ниже.
- Inject достаточно красителя, чтобы полностью заполнить желудочков. Это может занять несколько инъекций, чтобы заполнить пространство желудочка, в зависимости от стадии эмбриона.
Часть 4: изображений
- Используя чистую 1% агарозном покрытием блюдо, тыкать новые дыры в блюдо, удалить пробки, а также добавить к tricaine обезболить эмбрионов и предотвращения движения.
- Место хвост желудочка впрыском эмбриона в отверстие и положение для спины изображения.
- Возьмите изображения с помощью проходящего света.
- Это очень важно не двигаться эмбриона или микроскоп.
- Изменение параметров микроскопа и принимать изображения с флуоресцентным светом.
- Изменение положения эмбриона принять боковые изображения с обеих проходящем свете и флуоресцентного света.
- Сохранить изображение в виде файлов формата TIFF для обработки изображений в Photoshop.
Часть 5: Обработка изображений
- Для обработки изображений в Photoshop, откройте проходящего света и дневного света изображений одного эмбриона, принятых в том же положении. Будьте уверены, все настройки те же для каждого изображения.
- Перетащите флуоресцентные изображения на проходящем свете изображения и выстроить их точно.
- С флуоресцентное изображение выбрано, выберите "Изображение", "Корректировка", а затем "Заменить цвет" и изменить черный фон на белый.
- В "Заменить цвет" окна настройки "размытости" фактор, вплоть до флуоресцентных изображений выглядит однородным по цвету.
- В "Слои" окно, выберите "Multiply", чтобы просмотреть наложения изображений. Ваш желудочка пространстве изображения должны соответствовать передаваемого изображения свет точно.
- Сохраните этот файл и повторите для любых других изображений.
Представитель Результаты / Результаты
Правильное желудочка изображения инъекции показано на рисунке 1 панелей н.э., в то время как пример некорректного изображения инъекции показаны на ЕН. Правильное инъекции имеют острые края и не диффузный красителя. Неправильное инъекции, которая возникает, когда игла вводится слишком далеко в желудочке и хитов мозговой ткани ниже, может привести к краситель, который виден за пределами желудочка пространстве и в желтке.
Рисунок 1. Желудочка инъекций 25 HPF диких эмбрионов типа. (AD) Правильный метод инъекции и (EH) неправильным методом инъекции приведены в качестве примеров. (А, Е) Спинной образы светлого с соответствующими флуоресцентные изображения (B, F) и наложение люминесцентных и светлого изображения (C, G) и для правильного и неправильного инъекционные методы показано на рисунке. Стрелками указаны регионы, где краситель вышел за пределы пространства желудочков мозга из-за неправильной инъекции желудочка (см. "Устранение неисправностей"). Передняя находится слева на всех изображениях.
Устранение неполадок:
| Проблема Вызывать | Средство | |
| Вы давя эмбриона с иглой. | Ваша игла слишком тупой или наконечник слишком велик. | Начните с новой иглой и не разбить его, как далеко назад. Bevel иглу, чтобы сделать его резким, как иглы шприца. |
| Краситель всей эмбриона и желтком (см. рис 1E-H). | Ваша игла прошла через ткань и не остался в желудочке пространства. | Ваша игла не может быть достаточно острым, так что вы не в состоянии контролировать скорость прокола. |
| Краситель слишком слабы или не в переднем мозге. | Вы не использовали достаточно высокого давления для инъекций, или ваша игла не была достаточно далеко впереди достигают переднего мозга, когда вы вводили краситель. | Повысьте давление впрыска или разместить иглу чуть более передним во время инъекции. Вы можете поставить иглу через средний мозг, задний мозг границе, если более подробно, что требуется в переднем мозге. Вы также можете просто подождать немного для красителя дальнейшего диффузной до визуализации. |
| Ваш флуоресцентные изображения темные по краям после замены цветов в Photoshop. | Вы забыли изменить "размытости" настройки в окне заменить цвет. | Перемещение "размытости" вплоть до прямо в окне заменить цвет. |
| Игла не будет прокол заднего мозга roofplate. | Ваша игла не вырезано должным образом. | Сделать новую иглу. Если вы делаете много инъекций вам может понадобиться несколько игл, как они могут получить скучно. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео показано, как вводить флуоресцентного красителя (Техас-красный декстрана) в развивающиеся данио желудочков мозга. Этот метод используется для визуализации пространства желудочков мозга в отличие от окружающих нейроэпителия и является чрезвычайно полезным для определения формы желудочка пространства, а также форма окружающие ткани. Это позволяет нам лучше понять процесс образования мозга и желудочки мозга морфогенеза с течением времени в живых эмбрионов. Эта техника является превосходным инструментом для изучения мозга дефектов желудочка формирование и для начальных характеристик и изучение мутантов мозга морфогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Лаура Энн Лоури, который разработал эту технику в лаборатории. HS поддерживается NIHMH70926. Дженнифер Gutzman была поддержана CSBI / Merck докторской стипендии.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) | Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instrument Co. | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige International | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B.
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).
