זיהוי של חלבון Ubiquitination
Summary
Ubiquitination הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. מוטציות של גנים המעורבים שינוי זה קשור הרבה מחלות אנושיות שונות. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים בתרבית<em> In vivo</em> ו מבחנות<em> במבחנה</em>.
Abstract
Ubiquitination, את הקובץ המצורף קוולנטיים של היוביקוויטין פוליפפטיד למקד חלבונים, הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. הם כוללים היוביקוויטין, הפעלת אנזים E1, E2 היוביקוויטין-conjugating האנזים, האנזים E3 יוביקוויטין. בניגוד ל E1 ו E2, E3 המצע ligases היוביקוויטין סגוליות לתצוגה. מצד שני, אנזימים deubiquitylating יש תפקידים רבים בעיבוד חלבונים polyubiquitinated. Ubiquitination יכול לגרום לשינוי של יציבות חלבון, לוקליזציה הסלולר, ופעילות ביולוגית. מוטציות של גנים המעורבים במסלול ubiquitination / deubiquitination או תפקוד מערכת היוביקוויטין שינו המשויכים רבים מחלות אנושיות שונות, כגון סוגים שונים של סרטן, ניוון מוחיים, והפרעות מטבוליות. הגילוי של ubiquitination שינה או נורמלי של חלבונים היעד עשויה לספק הבנה טובה יותר על בפתוגנזה של מחלות אלה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים בתרבית<em> In vivo</em> ו מבחנות<em> במבחנה</em>. פרוטוקולים אלה שימושיים גם כדי לזהות שינויים אחרים היוביקוויטין כמו מולקולה קטנה כגון sumolyation ו neddylation.
Protocol
Discussion
במצגת זו, אנו הראשון שתיאר צעדים המאפשרים לזהות שינוי יוביקוויטין על החלבון של עניין בתאי יונקים בתרבית. על מנת לזהות ubiquitination במיוחד על החלבון של עניין, לא על הלא קוולנטית חלבונים אינטראקציה, היינו מצב מחמירים עבור תמוגה התא, immunoprecipitation ושטיפת 1,3. Ubiquitination, זוהה ע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים RO1 DC006497, RO1 NS057289 ו PO1 ES016738 (עד ז'ז'אנג); קליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה מענקים RS1-00331-1 ו-RL1 00682-1 (עד ז'ז'אנג); הפרקינסון האמריקאי מחלות האגודה ('עד ת'ג'אנג צ'ו י"ש); ואת ג'יי מייקל פוקס הקרן לחקר הפרקינסון (צ'אנג).
References
- Xiong, H. PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation. J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).
- Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity. Cell. 118, 83-97 (2004).
- Didier, C. RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization. Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).
- Laney, J. D., Hochsetrasser, M. Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination. Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).
