Detektion av protein Ubiquitination

Summary

Ubiquitination är en viktig posttranslational modifiering som utförts av en uppsättning av tre enzymer. Mutationer av gener involverade i denna förändring är förknippade med många olika mänskliga sjukdomar. Här beskriver vi protokoll för att upptäcka protein ubiquitination i odlade celler<em> In vivo</em> Och provrör<em> In vitro</em>.

Abstract

Ubiquitination, kovalent bindning av polypeptid ubiquitin till målproteiner, är en viktig posttranslational modifiering som utförts av en uppsättning av tre enzymer. De omfattar ubiquitin-aktiverande enzymet E1, ubiquitin-konjugera enzym E2 och ubiquitin ligas E3. Till skillnad från med E1 och E2, E3 ubiquitin ligases visa substrat specificitet. Å andra sidan, många deubiquitylating enzymer har roller i behandlingen polyubiquitinated proteiner. Ubiquitination kan leda till förändring av protein stabilitet, cellulär lokalisering och biologisk aktivitet. Mutationer av gener involverade i ubiquitination / deubiquitination väg eller ändras ubiquitin systemet att fungera är förknippade med många olika mänskliga sjukdomar, såsom olika typer av cancer, neurodegeneration och metabola sjukdomar. Upptäckten av förändrad eller normal ubiquitination av målproteiner kan ge en bättre förståelse för patogenesen av dessa sjukdomar. Här beskriver vi protokoll för att upptäcka protein ubiquitination i odlade celler<em> In vivo</em> Och provrör<em> In vitro</em>. Dessa protokoll är också användbar för att identifiera andra ubiquitin-liknande liten molekyl modifiering som sumolyation och neddylation.

Protocol

Detektion av protein ubiquitination i odlade celler Transfektera odlade celler med plasmider som uttrycker proteinet av intresse och (epitop-märkta versionen av) ubiquitin. Gör komplett buffert cellslys (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) med 2mm natrium orthovanadate, 50 mm natriumfluorid, och proteashämmare. Lyse cellerna med 100 l cellslys buffert per platta (6 cm maträtt). Om en större antenn används, justera volymen. Snurra skålen noga för att låta lyseringsbuffert …

Discussion

I den här presentationen beskrev vi de första stegen som möjligt upptäcka ubiquitin modifiering på ett protein av intresse i odlade däggdjursceller. För att upptäcka ubiquitination specifikt på proteinet av intresse, inte på icke-kovalent interagerande proteiner, använde vi en striktare villkor för cell-lys, immunoprecipitation och tvätt ^1,3. Ubiquitination, upptäcks av immunoprecipitation av målprotein i ett sådant hårda villkor följt av anti-ubiquitin immunoblotting, är därför sannolikt…