Cultura primario di miociti adulti Cuore Rat

Summary

In questo articolo, abbiamo descritto un modo tipico per isolare e cultura miociti adulti cuore di ratto. Collagenasi e proteasi sono utilizzati da digerire e isolare singoli miociti. Miociti colto seguire questo protocollo soddisfare le esigenze più sperimentare.

Abstract

Coltura primaria adulto cellule del cuore roditori sono un modello di sistema importante per la ricerca cardiovascolare. Tuttavia, la creazione di robusti, miociti vitali adulto colto può essere tecnicamente impegnativo, fattore limitante per molti ricercatori. Qui abbiamo descritto un protocollo per ottenere un elevato rendimento di miociti adulti cuore di ratto che rimangono vitali in coltura per diversi giorni. Il cuore è isolato e perfuso con collagenasi e proteasi in basso Ca^{2 +} Condizioni di recuperare singoli miociti. Ca^{2 +}-Tolerant cellule sono ottenute da un aumento graduale in extracellulare Ca<sup> 2 +</supConcentrazione> in tre successive fasi di lavaggio. Le cellule sono filtrati, risospeso in terreno di coltura, e placcato sulla scivola laminina rivestito. Miociti in coltura ottenuti usando questo protocollo sono vitali per un massimo di quattro giorni e sono adatti per la maggior parte degli esperimenti tra cui elettrofisiologia, biochimica, biologia molecolare e di imaging.

Protocol

Parte I. Preparazione per la chirurgia Il giorno prima della chirurgia ratto, accertarsi che tutte le soluzioni sono fatti, ma non aggiungere alcun enzimi ancora. Buffer A, B e il tampone di lavaggio dovrebbero essere filtrate per la sterilità prima di stoccaggio. I tamponi dovrebbero essere conservato a 4 ° C. 6-pozzetti colture di tessuti deve essere placcato con 10-20 mg / mL laminina in 2 ml 1XSFM il giorno prima come bene, e deve essere conservato a 37 ° C in un incubatore CO 2. <…

Discussion

Un passo fondamentale è la velocità con cui è appeso il cuore isolato sul sistema di perfusione. La durata del periodo di digestione enzimatica può essere un po 'diverso per ogni ratto. La regolazione dipende da come il cuore diventa morbida dopo il periodo normale di digestione. Il piano di recupero di Ca ^{2 +} dopo la digestione enzima è essenziale per ottenere le cellule sane Ca ^{2 +-tollerante.}

Per la cavia, il protocollo è lo stesso, tranne ialuronidasi vien…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
NaCl		Sigma	S6191
KCl		Sigma	P9541
HEPES		Sigma	H4034
K2HPO4		Sigma	P9666
MgSO4		Fluka	63068
Glucose		Sigma	G7021
CaCl2		Sigma	C7902
Heparin Sodium Salt		Sigma	H4784
Collagenase Type II		Worthington Biochemical	LS004176
Protease XIV		Sigma	P5147
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)		Sigma	B0753
Carnitine		Sigma	C9500
Taurine		Sigma	T0625
Glutamic Acid		Sigma	G1501
BSA		Sigma	A3294
Creatine		Sigma	C3630
Antibiotic		Cellgro	30-009-CI
Media 199		GIBCO	11150
FBS		Hyclone	SH30071.03
Laminin		BD Bioscience	354232
water bath		Fisher Scientific	15-462-5
variable flow chemical pump		Fisher Scientific	15-077-67
6-well culture plate		Corning	3516