遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離
Summary
高品質の単離は、インタクトなRNAは、多くの実験室のプロトコルで必須の工程である。ここで、我々は全体のゼブラフィッシュの胚と遺伝子発現のマイクロアレイ解析を含む様々な実験手順で、後続のアプリケーションのためのcDNA合成からのRNA抽出を示しています。
Abstract
多くの重要かつ複雑な実験手順は、高品質でインタクトなRNAの入力が必要です。劣化したサンプルや不純物の存在は、下流の実験的なアプリケーションでは悲惨な結果につながることができます。それは、優れたサンプルを確保するために多数の保護及び品質管理チェックと固体のテクニックを使用するために最も重要なこと、それゆえです。ここで、我々詳細商用RNA単離キットを用いてDNAと不純物の痕跡を除去するために市販の化学変性剤とそれに続くクリーンアップを使用して全体のゼブラフィッシュの胚からトータルRNAを分離するためのプロトコル。としてRNAは、直接RNA鋳型から合成されたcDNA産物を使用するほとんどのプロトコルはアッセイの遺伝子の発現は比較的不安定で、RNアーゼによる切断を容易に発生しやすくなります。我々は、詳細手順を市販のキットを使用して、より安定したcDNA産物にRNAに変換する。これらの手順を通して、サンプルは劣化や汚染がないことを保証するために数多くの品質管理チェックがあります。これらのプロトコルの最終製品は、マイクロアレイ解析、RT – PCRまたは長期保存に適しているcDNAである。
Protocol
Discussion
RNA分子の脆弱性は、このプロトコルを通じて忘れてはならない最も重要な考慮事項です。 RNaseフリーである滅菌装置は、常に研究室のRNaseフリーゾーンで使用する必要があります。 RNAのみの手続きに使用する実験室の一部を確保しておくと便利です。この領域は頻繁にアウェイなどRNaseなどRNアーゼ除去製品、を散布してください。 RNAサンプルは常に手袋を使用して処理し、劣化を防ぐため?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glycogen (5 mg/ml) | Ambion | 9510 | ||
| NanoDrop ND-100 | Thermo Scientific | ND-1000 | ||
| Pellet Pestles with Microfuge Tube | VWR | KT749520-0090 | ||
| Phase Lock Gel Light, 1.5 ml | Eppendorf | 2302800 | ||
| Phenol, Tris-saturated | Roche Diagnostics | 3117944001 | ||
| RNAse Away | VWR | 17810-491 | ||
| RNAse-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | ||
| RNEasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | ||
| SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 11904-018 | ||
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 |
