RNA Isolering från embryonala Zebrafish och cDNA syntes för Gene Expression Analysis

Summary

Isolering av hög kvalitet, är intakt RNA ett viktigt steg i många laboratorium protokoll. Här visar vi RNA-extraktion från hela zebrafisk embryon och cDNA syntes för senare tillämpning i olika experimentella procedurer inklusive genuttryck microarray analys.

Abstract

Många viktiga och komplexa laboratorie procedurer kräver en insats av hög kvalitet, intakt RNA. En försämrad prov eller förekomsten av föroreningar kan leda till katastrofala resultat i senare experimentella applikationer. Det är därför av yttersta vikt att använda fasta tekniker med många skyddsmekanismer och kvalitetskontroller kontroll för att garantera en överlägsen prov. Häri har vi detaljerat ett protokoll för att isolera totala RNA från hela zebrafisk embryon med ett kommersiellt tillgängligt kemiskt denatureringsmedel och efterföljande sanering för att avlägsna spår av DNA och föroreningar med ett kommersiellt RNA isolering kit. Eftersom RNA är relativt instabil och lätt utsatt för klyvning av RNaser, de flesta protokoll analys genuttryck med hjälp av ett cDNA produkt som är direkt syntetiseras från en RNA-mall. Vi detalj ett förfarande för att omvandla RNA till den mer stabila cDNA produkten med en kommersiellt tillgänglig kit. Under dessa förfaranden finns det många kvalitetskontroller för att säkerställa att provet inte är ned eller förorenats. Slutprodukten av dessa protokoll är cDNA som är lämplig för microarray analys, RT-PCR eller långvarig lagring.

Protocol

Del 1: Utvinning av Total RNA med hjälp TRIzol Reagent När du arbetar med RNA är det mycket viktigt att arbeta i en miljö som är fri från RNaser. Enkla försiktighetsåtgärder som att ha reserverat pipetter endast för användning med RNA förfaranden och sprutning arbetsområdet med ett saneringsmedel reagens (t.ex. RNAse Borta) innan proceduren är mycket hjälpsam. För att uppnå en tillräcklig mängd RNA pool 50 zebrafisk embryon i ett 1,5 ml mikrofugrör och ta bort …

Discussion

Bräckligheten i RNA-molekylen är den mest kritiska ersättning som bör komma ihåg i hela detta protokoll. Steril utrustning som är RNAse utan ska alltid användas i en RNAse zon av laboratoriet. Det är bra att reservera en del av laboratoriet som ska användas för RNA rutiner bara. Detta område bör ofta besprutas med en RNAse ta bort produkten, såsom RNAse bort. RNA-prover bör alltid hanteras med handskar och förvaras på is för att förhindra nedbrytning.

Detta protokoll drog f…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Glycogen (5 mg/ml)		Ambion	9510
NanoDrop ND-100		Thermo Scientific	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube		VWR	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml		Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated		Roche Diagnostics	3117944001
RNAse Away		VWR	17810-491
RNAse-Free DNase Set		Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit		Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR		Invitrogen	11904-018
TRIzol		Invitrogen	15596-026