アン試験管内でフルオロブロックの腫瘍の浸潤アッセイ

Summary

このビデオでは、蛍光ベースの方法論を用いて細胞培養用インサートを介して細胞の浸潤を測定する方法を示しています。

Abstract

転移性細胞の特徴は、基底膜を介して侵入し、体の他の部分に移行する能力です。細胞は、浸潤性であるためには基底膜を分解するだけでなく、移行の両方を分泌するプロテアーゼにできなければなりません。 BDアンジオジェネシスの腫瘍浸潤のシステムは、彼らの侵入特性の評価を可能にする条件下で細胞を提供する<em> in vitroで</em^1,2。それは一様にBDマトリゲルマトリックスで被覆された8.0ミクロンの細孔サイズのPETメンブレンのBDファルコンフルオロブロック24マルチウェルインサートプレートで構成されています。 BDマトリゲルマトリックスのこの均一な層は、再構成基底膜として機能<em> in vitroで</em侵略を勉強するための適切なタンパク質の構造を提示しながら>非浸潤細胞に真のバリアを提供する。コー​​ティングプロセスは、膜を介して移行するから非浸潤細胞をブロックし、膜の細孔を吸蔵。対照的に、浸潤細胞から自分自身を切り離し、被覆膜を介して移行することができます。細胞浸潤の定量は、このようなDiICなどの蛍光色素との事前または事後細胞浸潤のラベルのいずれかによって達成することができます。₁₂（3）またはカルセインは、それぞれ、AM、および浸潤細胞の蛍光を測定する。 BDフルオロブロックメンブレンは効果的に> 99％の効率で490から700 nmまでの光の通過を遮断するので、蛍光標識した浸潤していない細胞は下の読書蛍光プレートリーダーで検出されていません。しかし、膜の底面に浸潤している細胞は、光源から遮蔽されなくなりましたし、それぞれのプレートリーダーで検出されています。このビデオでは、カルセインが侵入した細胞を検出するために回答を使用して、エンドポイントの細胞浸潤アッセイを示しています。

Protocol

ポストラベリングとBDカルセインAM蛍光色素を用いて測定彼らがBDマトリゲルマトリックスを介して侵入し、BDフルオロブロックメンブレンを通過した後の細胞を定量にラベルが付いています。その結果、細胞浸潤の唯一のエンドポイントの測定を得ることができる。 〜80％コンフルエントに細胞を成長させる。 インサートシステムを準備し、再水和する。 -20℃の保管からパッケージを削除し、それが室温に来ることができます。 箔のパッケージを開き、挿入井戸の内部に500μL温かい（37℃）のメディアを追加します。プレートは37℃で2時間再水和することを許可° C、5％CO 2を 。 注 ：これは、細胞遊走のコントロールとして使用されるコーティングされていないBDファルコンフルオロブロック24マルチウェルインサートシステムを再水和するために必要ではない。 再水和した後、慎重にメンブレン上にBDマトリゲルマトリックスの層を乱すことなく挿入ウェルから培地を取り除く。システムが使用できるようになりました。 細胞単層をトリプシン処理し、5 × 10 4細胞/ mLで無血清DMEMで細胞を再懸濁することにより細胞懸濁液を準備します。 注 ：異なる細胞タイプを使用している場合に、最適な播種密度を決定する必要があります。多孔質の成長表面上の細胞のタイプに最適な播種密度を決定するために、播種密度の範囲を（細胞/ cm 2）を使用して、ブラケットの非多孔質表面に使用される播種密度（すなわちフラスコ、ディッシュ、プレート）。たとえば、間に種々の細胞の濃度で2.5 × 10 5細胞/ cm 2、シードでは、現在シード5 × 10 4と5 × 10 5細胞/ cm 2、最適な初期播種密度を決定する。 頂端チャンバーに細胞懸濁液の500μL（2.5 × 10 4細胞）を追加します。 アクセスのためのサンプルポートを使用して、基底チャンバーのそれぞれに走化性因子の750μL（DMEMで5％FBS）を追加します。 BDのアンジオジェネシスの腫瘍浸潤のシステムと非塗工BDファルコンフルオロブロック37℃、5％CO 2雰囲気で20〜22時間、24マルチウェルインサートプレートをインキュベートする。 インキュベーション後、慎重に根尖チャンバーから培地を取り除く。これは、廃棄用容器に内容をフリックすることで実現できます。インサートシステムの底面に触れないでください。 500μL/ウェル、4μg/ mLのカルセインHBSSでAMを含む第二の24ウェルプレートへの挿入システムを転送します。 37℃で1時間インキュベート° C、5％CO 2。それは細胞質エステラーゼにより緑色蛍光カルセインに変換される蛍光性生体染色色素であるため、カルセインAM溶液が蛍光を読み取る前に、下室から削除されません。 浸潤細胞の蛍光は、ボトム読み蛍光プレートリーダーで517分の494 nmの（EX / EM）の波長で読み取られます。ゲイン設定は、経験的に決定する必要があるかもしれませんが、中間点のゲインは十分な出発点でなければなりません。高すぎるゲイン設定は、高い蛍光試料と検出器の飽和につながる可能性がありますが、これは意味のある結果の取得を防ぐことができます。 autogain（あなたの読者にサポートされている場合）の使用は推奨されません。倒立蛍光顕微鏡は、結果を検証するために使用することができますが、この度は、このアッセイを初めて実行した操作を行うために特に便利です。 注 ：これは、挿入システムが正しいプレートのマップを使用して読み込まれることは重要である。載荷板のマップの詳細についてはwww.bdbiosciences.comまたは接触BDテクニカルサポート（labware@bd.com）でBDの技術告示第436参照してください。プレートをリーダーに挿入されるように適切な板の向きが右に向き左上隅とBD小瓶のロゴでもA1となります。 データの削減データは次式のように表される。 背景は、パーセントの細胞の浸潤の計算の前に減算されることがあります RFU =相対蛍光ユニット。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
BD BioCoat Tumor Invasion System		BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells		ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control		BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye		BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling		BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities		PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.