Une In vitro Essai FluoroBlok invasion tumorale

Summary

Cette vidéo montre comment mesurer l'invasion des cellules par le biais inserts de culture cellulaire en utilisant une méthodologie basée sur la fluorescence.

Abstract

La caractéristique des cellules métastatiques est leur capacité à envahir travers la membrane basale et migrent vers d'autres parties du corps. Les cellules doivent être en mesure de deux protéases sécrètent qui décomposent la membrane basale ainsi que la migration afin d'être envahissantes. BD BioCoat système fournit l'invasion tumorale des cellules avec des conditions qui permettent l'évaluation de leur propriété invasives<em> In vitro</em^1,2. Il se compose d'un FluoroBlok BD Falcon 24 Multiwell Plate Insertion avec une membrane 8,0 micron pores PET qui a été uniformément revêtu de BD Matrigel Matrix. Cette couche uniforme de BD Matrigel matrice sert de membrane basale reconstituée<em> In vitro</em> Offrir une véritable barrière à la non-invasif des cellules tout en présentant une structure de protéine appropriée pour étudier l'invasion. Le procédé de revêtement obstrue les pores de la membrane, bloquant non-invasif des cellules de migrer à travers la membrane. En revanche, les cellules invasives sont capables de se détacher de et migrent à travers la membrane revêtue. La quantification de l'invasion des cellules peut être réalisée soit par l'étiquetage pré-ou post-invasion de la cellule avec un colorant fluorescent tel que dIIC₁₂ (3) ou calcéine AM, respectivement, et en mesurant la fluorescence des cellules envahissant. Depuis la membrane BD FluoroBlok bloque efficacement le passage de la lumière de 490 à 700 nm avec une efficacité> 99%, marqués à la fluorescence des cellules qui n'ont pas envahi ne sont pas détectés par un lecteur en bas de lecture de plaques de fluorescence. Cependant, les cellules qui ont envahi le dessous de la membrane ne sont plus à l'abri de la source lumineuse et sont détectés avec le lecteur de plaque respectifs. Cette vidéo montre un test d'invasion critère cellule, en utilisant calcéine AM pour détecter les cellules envahies.

Protocol

Post-étiquetage et de mesure en utilisant BD calcéine AM colorant fluorescent Les cellules sont marquées pour la quantification, après qu'ils ont envahi par la Matrice BD Matrigel et passé à travers la membrane BD FluoroBlok. En conséquence, la mesure ne critère d'invasion de cellules peuvent être obtenues. Cultiver des cellules à confluence ~ 80%. Préparer et réhydrater le système d'insertion. Retirez le paquet de -20 ° C pour le stockage et lui permettre de venir à la température ambiante. Ouvrez la papillote et ajouter 500 ul chaude (37 ° C) des médias à l'intérieur du puits d'insertion. Laisser la plaque pour se réhydrater pendant 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Remarque: Il n'est pas nécessaire pour réhydrater le non couchés BD Falcon FluoroBlok 24 Multiwell Système Insérez qui sera utilisé comme un contrôle de la migration cellulaire. Après réhydratation, retirez soigneusement le support de l'insertion des puits sans déranger la couche de BD Matrigel Matrice sur la membrane. Le système est maintenant prêt à utiliser. Préparer les suspensions de cellules par trypsinisation monocouches de cellules et de remise en suspension des cellules dans du DMEM sans sérum à 5 x 10 4 cellules / mL. Remarque: Si vous utilisez un type cellulaire différent, vous devez déterminer la densité de semis optimale. Pour déterminer la densité de semis optimale pour votre type de cellules sur une surface poreuse de croissance, utiliser une gamme de densités de semis (cellules / cm 2) que les crochets de la densité d'ensemencement utilisé sur les surfaces non poreuses (c. flacons, plats et assiettes). Par exemple, si vous avez actuellement semences à 2,5 x 10 5 cellules / cm 2, de semences à des concentrations de cellules différentes entre 5 x 10 4 et 5 x 10 5 cellules / cm 2 pour déterminer la densité de semis optimale initiale. Ajouter 500 ul de suspension cellulaire (2,5 x 10 4 cellules) dans les chambres à apicale. Ajouter 750 ul de chimiotactique (5% de FBS dans DMEM) pour chacune des chambres basal, en utilisant les ports de l'échantillon pour l'accès. Incuber la BD BioCoat tumeur du système invasion et la non couchés BD Falcon FluoroBlok 24 Multiwell Plate Insertion pour les 20-22 heures à 37 ° C, 5% de CO 2 atmosphérique. Après l'incubation, retirer soigneusement moyenne des chambres apicale. Ceci peut être accompli en feuilletant le contenu dans un conteneur à déchets. Ne touchez pas la surface du fond du système d'insertion. Transférer le système de l'insérer dans une seconde plaque de 24 puits contenant 500 ul / puits de 4 pg / mL calcéine AM dans HBSS. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C, 5% de CO 2. La solution calcéine AM n'est pas retiré de la chambre basse avant de lire la fluorescence car il est un colorant non fluorescent vitale qui est converti en calcéine fluorescente verte par les estérases cytosoliques. Fluorescence des cellules envahies est lu à 494/517 nm longueur d'onde de (Ex / Em) sur un lecteur de bas en lisant la plaque fluorescente. Le réglage du gain peut être nécessaire de déterminer de façon empirique, mais un gain médian devrait être un point de départ suffisant. Un réglage de gain qui est trop élevée peut conduire à une saturation du détecteur avec un échantillon très fluorescentes, ce qui peut empêcher l'acquisition de résultats significatifs. L'utilisation de autogain (si supporté par votre lecteur) n'est pas recommandée. Un microscope inversé à fluorescence peut être utilisée pour vérifier vos résultats, il est particulièrement utile pour ce faire, la première fois que vous exécutez ce test. Note: Il est primordial que les systèmes d'insertion sont lues à l'aide de la carte de la plaque correct. Pour plus d'informations sur les cartes plateau de chargement vois BD Bulletin technique n ° 436 sur www.bdbiosciences.com ou contactez BD Support technique (labware@bd.com). Une bonne orientation de plaque est avec le puits A1 dans le coin supérieur gauche et le logo BD Flacon orientée vers la droite comme la plaque est insérée dans le lecteur. Réduction des données Les données sont exprimées comme dans l'équation suivante: Contexte peut être soustraite avant le calcul de l'invasion des cellules pour cent RFU = unités relatives fluorescentes.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
BD BioCoat Tumor Invasion System		BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells		ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control		BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye		BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling		BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities		PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.