Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada
Summary
Aqui demonstramos os protocolos para a realização de uma única molécula de microscopia de fluorescência em células vivas de bactérias para habilitar funcionais complexos moleculares a serem detectados, rastreados e quantificados.
Abstract
Pleno conhecimento sobre os mecanismos de células vivas só pode ser alcançada por investigar os processos-chave que provocam direta e eventos em um nível celular. Até o momento a complexidade de cisalhamento de sistemas biológicos tem causado experimentação molécula única precisa ser demasiado exigentes, em vez enfocando estudos de sistemas simples utilizando granel relativamente rudimentar ensemble da média das medições. No entanto, muitos processos importantes ocorrem na célula viva no nível de apenas uma ou algumas poucas moléculas; medições ensemble geralmente mascaram a natureza estocástica e heterogénea desses eventos. Aqui, utilizando microscopia óptica avançada e ferramentas de análise de análise de imagens que demonstram como monitorar proteínas dentro de uma única célula viva bacteriana com uma precisão de moléculas individuais e como podemos observar a dinâmica dentro de complexos moleculares em funcionamento máquinas biológicas. As técnicas são diretamente relevantes fisiologicamente. Eles são minimamente perturbativos e não-invasivo para a amostra biológica em estudo e estão totalmente sintonizadas para as investigações na vida material, recursos não disponíveis para outros uma única molécula de abordagens de biofísica. Além disso, as amostras biológicas estudadas todas as produzem a proteína fluorescente marcadas em níveis que são quase idênticas às cepas de células não modificadas ("codificação genômica"), ao contrário da abordagem mais comum, mas menos ideal para a geração de proteínas significativamente mais do que ocorreria naturalmente ('expressão plasmídeo). Assim, as amostras biológicas reais que serão investigadas são significativamente mais dos organismos naturais, e, portanto, as observações mais relevantes para os reais processos fisiológicos.
Protocol
Discussion
É preciso ter cuidado para não "sobre cisalhamento" célula para olhar as bactérias amarrados, pois isso pode prejudicar a funcionalidade dos motores flagelares. É importante o uso de células por muito mais tempo do que uma hora uma vez na lâmina de microscópio, uma vez que pode tornar-se falta de oxigênio. Otimização considerável pode ser necessária para encontrar as melhores condições de imagem do microscópio servidos ao seu sistema biológico específico sob investigação. Pode ser sábio pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos as doações tipo de cepas de bactérias do grupo do Prof Judith Armitage (Universidade de Oxford, UK) e Conrad Prof Mullineaux (Queen Mary University of London, UK). IMD é financiado conjuntamente pelo Departamento de Bioquímica (Universidade de Oxford) e OCISB; AR é financiado por uma Engenharia e Ciências Físicas Research Council (EPSRC) studentship DTC; ND é financiado pelo Biotecnologia e Ciências Biológicas Research Council (BBSRC); MCL é financiada por uma Universidade Royal Society Fellowship Research.
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