Summary

Автоматизированная система для одной молекулы флуоресцентной Измерения поверхностного иммобилизованных биомолекул

Published: November 02, 2009
doi:

Summary

В этой статье мы опишем, как мы получаем FRET следы от отдельных молекул ДНК, иммобилизованных на поверхности с помощью автоматизированной сканирующей конфокальной микроскопии.

Abstract

Резонансной флуоресценции передачи энергии (FRET) микроскопия нашла широкое применение для изучения структуры и динамики молекул биологического интереса, такие, как нуклеиновые кислоты и белки. Одноместный молекулы FRET (см-FRET) измерений на иммобилизованных молекул разрешения длительные наблюдения системы эффективно, пока обе красителей photobleach-в результате чего время-следы, что отчет о динамике биомолекулярных с широким спектром временных масштабах от миллисекунд до нескольких минут. Для облегчения приобретения большого количества следов для статистического анализа, процесс должен быть автоматизирован и окружения образца должны быть под жестким контролем в течение всего времени измерений (~ 12 часов). Это достигается с помощью автоматизированной сканирующей конфокальной микроскопии, который позволяет допроса тысяч одиночных молекул в одночасье, и микрожидкостных клетка, которая позволяет контролируемого обмена буфера, с ограниченным содержанием кислорода и поддерживает постоянную температуру на протяжении всего периода измерения. Здесь мы показываем, как собрать микрожидкостных устройств и инструкции по активации ее поверхности для иммобилизации ДНК. Затем мы объясняем, как подготовить буфер для максимально фотостабильности и срок службы флуорофоров. Наконец, мы покажем этапы подготовки установки для автоматизированного приобретения с временным разрешением одной молекулы FRET следы молекул ДНК.

Protocol

1 – Сборка микрожидкостных ячейки Микрожидкостных ячейки производится путем слияния с рисунком, толщиной 2 мм, полидиметилсилоксан (PDMS) диск только что очищенный кварц скольжения покрытия. PDMS диск содержит четыре 30 мкл прямоугольных камерах, к которым обращаются входе и выходе гибкие капилляры связано с резервуаром буфера и шприцевой насос, соответственно, для контролируемого потока буфера. Проточной ячейке поддерживается на ее обратной стороне на оконное стекло и помещен на заказ ячейкой содержащей водяным охлаждением термоэлектрический элемент для регулирования температуры. Для того, чтобы узорной PDMS диск, смешать 10 частей силиконового эластомера базу с 1 частью отвердителя, тщательно перемешать и оставить дегазации в течение 1 часа в вакууме. Осторожно вылейте смесь эластомера на микрожидкостных форму клетки. В нашем случае это 1 "кремниевой пластины с четырьмя полосами (1×10 1×10 4 х 3 х 300 мкм) из отрицательного фоторезиста. Оставьте это вылечить на горячей плите при температуре 70 ° С в течение двух часов. Тщательно очистите вылечить PDMS диск из форм использования лезвия бритвы. Предохранитель диска на 1''стекла (содержащий 8 х 2 мм в диаметре предварительно просверленные отверстия на обоих концах канала) плазмой окислительных обе поверхности в течение 30 секунд. Предохранитель стекла на плоской стороной диска PDMS (сторона не содержащие каналов). Вставьте 2-дюймовый длинный гибкий плавленого кварца капиллярную трубку через отверстие каждый стакан окна, пока не достигнет канала. Вставка иглы, а затем следующие с капиллярной могут облегчить этот процесс. Уплотнение стекла отверстия с помощью быстрого отверждения силиконового литья соединения, такие как Kwik-Cast. Промыть каналов с этанолом и водой, и плазменно-активировать камере вместе с только что очищенный, 1-дюймовый круговой кварца скольжению покрытие в течение 30 секунд. Мы предлагаем очистку это покрытие скольжения использованием пираньи *. Предохранитель покровным стеклом в сторону ячейки, содержащей каналы, герметизация камер. Оставьте собрал ячейки вылечить в течение ночи при комнатной температуре. * Piranha является решением H 2 O 2 и H 2 SO 4 в 1:2.5 пропорциях. Для очистки крышка скользит, погрузите их в пираний при 90 ° С в течение 20 мин. 2 – активация поверхности для иммобилизации молекул Для исследования нуклеиновых кислот, Простейшая схема поверхности иммобилизации состоит из первого слоя стекла или кварца скольжения накрыть биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА), а затем стрептавидином. Это позволяет биотинилированного образца будет заблокирован с высокой специфичностью в течение нескольких дней при комнатной температуре. Подключите гибкий шланг с капиллярами для легкой инъекции буфера с помощью шприца и иглы. Inject раствор 0,1 мг / мл биотинилированного БСА в буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, фильтруется с помощью фильтра 0,02 мкм) в канал и инкубировать в течение 30 мин. Поток 300-500 мкл буфера для удаления любых свободных биотинилированного BSA из канала, стараясь не поймать пузырьки воздуха внутри камеры. Inject раствор 0,1 мг / мл в буфере стрептавидином и инкубировать в течение 15 мин. Затем повторите шаг 3. Поток через 3-5 рМ решение биотинилированного образца. Выполните проверку поверхности и проверить освещение флуоресцентными молекулами. При необходимости увеличивают концентрацию образца для получения лучшего покрытия сетей. Инкубируйте в течение 10 минут и повторите шаг 3. Микрожидкостных ячейка монтируется на этапе моторизованных ху позволяет грубые (до 25 мм), движения с помощью оптически закодированные двигатели постоянного тока, и мелкие (1 нм) движение с помощью двух замкнутых пьезоэлектрические приводы (Physik Instrumente модели М-014 или аналогичные). Это можно сделать либо до, либо после активации поверхности образца иммобилизации. 3 – Подготовка буфера изображений (IB) IB состоит из кислорода ферментативной очистки системы и триплетного тушителя, таких как Trolox. С IB сбрасывается через постоянно на ночь, не менее 10 мл должны быть подготовлены заранее. Подготовка 10 мл 0,8% м / о D-глюкозы, по крайней мере 35 мМ Трис-HCl рН 8,0 и 50 мМ NaCl в деионизованной воде. Чем выше концентрация буфера важно по двум причинам: растворение Trolox будет окисляться решение, и ферментативной реакции будет также ниже рН раствора с течением времени. Так как это решение имеет длительный срок хранения может быть сохранен как маточный раствор. Растворите 5 мг Trolox в буфер, подготовленный в шаге 1 на вортексе в течение нескольких минут, а затем встряхивания в течение> 10 мин. Trolox не очень хорошо растворяется в воде при рН> 7, поэтому не спешите этого шага. Фильтры решения с использованием 0,2 мкм и оставить дегазации в вакууме в течение 10 минут. Подготовка "gloxy" ферментативных решение путем смешивания 60 мкл Уотг, 20 мкл 5X буфера, 20 мкл каталазы, 1 мг оксидазы глюкозы и 100 мкл 10 мг / мл BSA. Фильтры решения с использованием 0,22 мкм центрифуги фильтр. Аккуратно перемешайте буфер, начиная с шага 2 с "gloxy" решение с шага 3 избегая образования воздушных пузырей. Поток IB через канал с постоянной скоростью 5 мкл / мин с использованием механических насосов шприца для контроля расхода. Bubble аргона в IB резервуар для предотвращения кислородом воздуха от повторного растворения в буфер. Сканирования поверхности, локализацию молекулы и приобретение одного следы интенсивности молекула находится под контролем программы LabView, которая позволяет автоматизированного сбора данных 1. Программа сканирует 20×20 мкм 2 областях на 0,2 мкм резолюцию, со скоростью 0,1 мкм / мс. Данные сразу же обрабатываются для получения интенсивности-взвешенный расположение всех пикселей выше фона имеет значение. После иммобилизованных молекул будут найдены, они перемещаются по одному в конфокальной объема и интенсивности донора и акцептора флуорофора регистрируются как функция времени, пока обе photobleach флуорофоров. Стадия затем запрограммировать на переход к новой происхождения 100 мкм далеко, и процесс сканирования повторяется. 4 – представитель Результаты Ниже приведены некоторые изображения, показывающие собравшихся микрожидкостных клетке до активации поверхности и после того, установлен на микроскоп готов к молекуле иммобилизации. Если канал успешной активации, сканирует поверхность должна быть похожа на сканирование показано ниже показаны выбросы доноров красителя (зеленый) и акцепторных (красный) после прямого возбуждения донора. Эти молекулы перемещаются по одному в зондировании объем и флуоресценции регистрируется в течение долгого времени, пока обе photobleach красители, как показано на одном следы молекулы. Из следов подобных можно получить FRET эффективность, которая сообщает о мгновенной донорно-акцепторных разделение, которое в свою очередь, используется для изучения структуры и динамики молекул биологического интереса. Рисунок 1: микрожидкостных клетка с четырьмя каналами, каждый из которых вход / выход капилляров. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1. Рисунок 2: Сотовый установлен на микроскоп готов к измерениям. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2. Рисунок 3: Настройка для SM-FRET измерений. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 3. На рисунках 4 и 5: Красный и зеленый канал сканирования поверхности иммобилизованных FRET молекул, возбужденных с зеленым лазером. Пожалуйста, нажмите, чтобы увидеть большую версию рисунке 4 , или рисунке 5 . 6, 7, 8 и 9: Интенсивность траектории донора (зеленый) и акцепторных (красный) флуорофоров маркированы, чтобы молекулы ДНК 8, 10, 16 и 18 пар оснований друг от друга. Пожалуйста, нажмите, чтобы увидеть большую версию рисунок 6 , рисунок 7 , рисунок 8 , или на рисунке 9 .

Discussion

Хотя приведенный выше протокол был оптимизирован для нашей конкретной системы и конкретного выбора красителей (ПМР и ATTO647N), это отнюдь не только доказал методом. В последнее время альтернативные поглощающего кислород система, состоящая из протокатеховая кислоты (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PCD) было показано, что увеличение фотостабильности некоторых красителей 4. Кроме того, другие триплетного состояния жажду, таких как β-меркаптоэтанола (BME) может быть использован вместо Trolox, хотя они не могут подавить длительного мигание некоторых красителей, в частности Cy5 5.

Хотя иммобилизации с помощью биотин-стрептавидин-биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА) является предпочтительным выбором для исследования нуклеиновых кислот, полиэтиленгликоля (PEG)-покрытием лучше подходит для исследования белков, поскольку она препятствует неспецифической адгезии 1. Кроме того, к югу от дифракционной пузырьки размер может быть использован для инкапсуляции биомолекулы интересов в случаях, когда это может повлиять на поверхности взаимодействия 6.

В этой статье мы использовали конфокальной установка оснащена силиконовыми лавинных фотодиодов приобрести флуоресценции следы интенсивности. Этот протокол работает одинаково хорошо с полным внутренним отражением флуоресцентный микроскоп (TIRF), оснащенных ПЗС-камер. Независимо от того, использовали микроскопию, см-FRET можете сообщить по пространственным разрешением приближается ангстрем, когда донор и акцептор сигнал должным образом исправлены 7.

Acknowledgements

Мы благодарим Чандран Sabanayagam за помощь в разработке системы, Джошуа Эдель за советом по проектированию микрожидкостных устройств и сотрудников Rowland института Гарвардского университета для обработки деталей установки. Мы признаем, полезные обсуждения с членами группы Меллер по адресу Rowland института и Бостонского университета, и члены группы Т. Ха "с при UIUC для полезной информации. Наконец, мы ценим финансовой поддержке Национального научного фонда (PHY-0701207) и Национального Института Здоровья (GM075893).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Fused silica capillary tubing   Polymicro Technologies TSP150375  
Fused silica cover slip   Esco Products R425000  
Tubing   Diba Industries    
Biotinylated BSA   Sigma A8549  
BSA   Sigma A9085  
Streptavidin   Thermo Scientific 0021122  
Sylgard 184 Elastomer Kit   DowCorning 3097366-1004 Silicone Elastomer Kit
Trolox   Aldrich 238813  
Catalase   Sigma C3155  
Glucose Oxidase   Sigma G2133  
D-Glucose   Sigma G7528  
Kwik-Cast Sealant   World Precision Instruments Kwik-Cast Silicone Casting Compound

References

  1. Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
  2. Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
  3. Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
  4. Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  5. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  6. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
  7. Di Fiori, N., Meller, A. . Article in preparation. , .

Play Video

Cite This Article
Di Fiori, N., Meller, A. Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules. J. Vis. Exp. (33), e1542, doi:10.3791/1542 (2009).

View Video