Выделение и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)

Summary

Protocol

Всего подготовку костного мозга

1. Четыре B6 мышей забивали и расчлененный получить большеберцовые кости, бедренные кости, бедра и позвоночник.
2. Во время вскрытия, конечностей и костей находятся в PBS 2% FCS тепла инактивированной (опционально 2 мМ EDA - рассечение среды).
3. Чистые кости измельчают с ступки и пестика в рассечение среды. Эффективный способ сделать это раздавить большеберцовые кости, бедра и бедра каждой мыши, а затем 2 шипами на время.
4. Смесь клеток полученных из каждой мыши хранятся отдельно и фильтруют через 40 мкм фильтр в 50 мл трубки сокола. Таким образом, каждая трубка содержит ячейку смесь, полученную из всех ног костей мыши, и половина из полученной смеси с 2 шипами. На данном этапе фильтр используется для разделения кости мусора.
5. Как правило, рекомендуется сокрушить кости ног дважды, чтобы получить белый (без костного мозга) костных фрагментов, а также фрагменты позвоночника 2 или 3 раза.
6. Заполнение трубы, чтобы они сбалансированы, и спина 5 1200rpm мин.
7. Аспирируйте супернатант и ослабить гранул путем перетаскивания труб на трубе стойки (этот шаг важен после каждого центрифугирования, чтобы минимизировать образование скопления и клеточных потерь). Ресуспендируют каждой трубки в 1 мл PBS 2% FCS (NO ЭДТА с сегодняшнего дня), если вы делаете линии истощения, или в любом объеме иным удобным для Вас.

Lineage истощения

1. Эта процедура позволяет устранить высоко дифференцированные клетки и получить очень гетерогенной популяции клеток, обогащенные для стволовых и прогениторных клеток. Если вы сортировки HSC, этот шаг существенно сокращает количество ячеек, которые должны пройти через сортировки клеток, тем самым уменьшая время сортировки и позволяет Вам сортировать HSC из большего количества мышей, так что вы можете получить большее количество HSC в одном сортировки.
2. Если вы собираетесь для сортировки позже, вывезти 50 мкл клеточной смеси (обычно я взять немного из каждой пробирки) для сортировки элементов управления (неокрашенные и SCA1, с-Kit, CD48, Flk2 одного управления цветом).
3. Добавить Лин коктейль 30ml/tube. Lineage коктейль содержит различные антитела, которые, к сожалению немного меняется из лаборатории в лабораторию. В лаборатории Скадден, мы используем biotinilated антител против Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Их окончательное растворение в окрашивание 1:700.
4. Vortex быстро перемешать, и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° C.
5. Во время инкубации, подготовить колонн на магниты и 15 мл пробирки элюирования под колоннами. Дега некоторые PBS использованием steriflip фильтр (вы увидите маленькие пузырьки воздуха движется к поверхности PBS за счет вакуум-аспирация), и равновесие колонн с применением 3 мл дегазированной PBS для каждого столбца.
6. Колонке потока составляет около 1ml/5min, поэтому она занимает около 15 минут, чтобы колонны готовы к использованию.
7. В конце инкубации, добавьте PBS 2% FCS для заполнения трубы и со спином вниз в течение 5 мин при 1200rpm.
8. Аспирируйте супернатант, ослабьте окатышей и ресуспендируют в 1 мл / труба дегазированной PBS.
9. Если вы сортировка позже, вывезти общего костного мозга Lineage один цвет окрашивания Ctrl (15 мл, немного из каждой пробирки).
10. Добавить стрептавидин 30ml/tube бусы, вихрь быстро перемешать, и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° C.
11. В конце инкубации, добавьте 2 мл / трубка дегазированной PBS. Положите новую коллекцию под трубы колонны, и применять каждый подвески на колонку, фильтрации через 40 мкм фильтр.
12. Добавьте еще 3 мл дегазированной PBS в каждую пробирку, чтобы вымыть его. Как только столбцы пусты, применяется еще раз, используя те же 40 мкм фильтр.
13. Элюат содержит линии обедненного ячейки смеси, обогащенные гетерогенной популяции стволовых клетках и прародителей. Бассейн содержание 4 трубы на 2 трубки. Спиновые в течение 5 мин при 1500 об.
14. Аспирируйте супернатант. Осадок должен быть белым или в основном белые. Ослабить окатышей и ресуспендирования их вместе в 1 мл PBS общая 2% FCS, если вы сортировка позже, в противном случае ресуспендируют в любом объеме удобно для вас.

ЛКС или долгосрочной сортировки HSC

1. Выньте линии обедненного один цвет окрашивания Ctrl (15 мл). Это позволит вам оценить эффективность вашей линии истощения.
2. Смесь клеток для сортировки окрашивается в 15 мл трубки.

Добавить антител:

Sca PE-Cy5.5	1: 100	10мл
Комплект APC	1:100	10мл
С. А. PE-Cy7	1:500	2 мл

Для сортировки долгосрочных HSC, а также добавить:

CD48 FITC	1:1000	1 мл
Flk2 PE	1:200	5 мл

Кроме того, подготовить единый окрашивания элементов управления с помощью общего костного мозга хранятся в сторону после вскрытия и общий костного мозга происхождение пятна. Эти окрашивания может быть сделано непосредственно в пробирки СУИМ.

Убедитесь в том, чтобы в темноте!

1. Vortex быстро перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 до 30 минут, повторное смешивание полпути.
2. Чтобы смыть избыток антител, заполнить трубы с PBS 2% FCS и спина в течение 5 мин при 1500 оборотах в минуту.
3. Удалить супернатант, ресуспендируют все гранулы и переместить их в новых трубах FACS с фильтром шапки. Это может занять некоторое время, чтобы клетки, чтобы пройти через эти фильтры, и очень важно, чтобы применить некоторые более PBS потом мыть фильтр и свести к минимуму потерю клеток. Этот шаг необходим, чтобы избежать засорения сортировщик, который является самым страшным кошмаром каждого пользователя сортировщика клеток.
4. Когда раздавать ваши клетки на объект сортировки клетки, не забудьте также подготовить трубку с PBS 10% HI ФТС, где клетки будут собраны.
5. Если вы сортировки ЛКС клетки, вы получите гетерогенной популяции содержащие долгосрочные и краткосрочные заселения HSC и мультипотентных предшественников. Средняя урожайность составляет 300000 ЛКС из 4 мышей.
6. Если у вас есть также используется CD48 и Flk2 антител, можно разделить каждой популяции долгосрочных HSC, короткая HSC срок и MPP. LT-HSC являются наиболее редкими населения. Средняя урожайность составляет около 50000 до 60000 от 4 клетки мышей.