La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

Summary

Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

Abstract

La encapsulación en 3D de las células dentro de los hidrogeles representa una técnica cada vez más importante y popular para el cultivo de células y en el desarrollo de las construcciones de ingeniería de tejidos. Este entorno mejor imita lo que observamos en las células in vivo, en comparación con el cultivo de tejidos estándar, debido a las propiedades como el tejido y el medio ambiente 3D. Hidrogeles poliméricos sintéticos son agua hinchada redes que pueden ser diseñados para ser estables ni degradar a través de la hidrólisis o proteólisis de nuevo tejido se deposita en las células encapsuladas. Una amplia variedad de polímeros se han explorado para estas aplicaciones, tales como poli (etilenglicol) y el ácido hialurónico. Por lo general, el polímero es funcionalizado con grupos reactivos, tales como metacrilatos o acrilatos capaz de sufrir entrecruzamiento través de diversos mecanismos. En la última década, el progreso se ha hecho mucho en la ingeniería de estos microambientes - por ejemplo, a través de la incorporación covalente física o pendiente de las señales bioquímicas - para mejorar la viabilidad y el fenotipo celular directa, incluyendo la diferenciación de las células madre encapsulado (Burdick et al.).

Los siguientes métodos para la encapsulación de células en 3D se han optimizado en nuestros laboratorios y otros para maximizar cytocompatibility y minimizar el número de pasos de procesamiento de hidrogel. En los siguientes protocolos (ver Figura 1 para ver una ilustración del procedimiento), se asume que los polímeros funcionalizados capaz de sufrir entrecruzamiento ya están en la mano, excelentes críticas de la química de los polímeros que se aplican al campo de la ingeniería de tejidos se pueden encontrar en otros lugares (Burdick et al.) y los métodos que sean compatibles con una amplia gama de tipos de polímeros. Además, la adición tipo Michael (ver Lütolf et al.) Y la iniciada por la luz de los radicales libres (ver Elisseeff et al.) Se centró en los mecanismos de aquí constituyen sólo una pequeña parte de las técnicas de reticulación informó. Entrecruzamiento de modo mixto, en el que por primera vez una parte de los grupos reactivos consumidos por entrecruzamiento de suma y seguido por un mecanismo de radicales, es otro paradigma de uso común y de gran alcance para dirigir el fenotipo de las células encapsuladas (Khetan et al., Salinas et al.).

Protocol

A. Preparación de Material y Esterilización

1. Antes de la preparación de materiales de encapsulación, preparar una solución de 0,5% en peso del fotoiniciador Irgacure 2959 (I2959) en tampón fosfato salino (PBS), mezclando e incubando durante varios días a 37 ° C. La solución puede ser filtrada para la esterilización de la jeringa y se almacena a temperatura ambiente durante el uso prolongado.
2. Sobre la base de la composición deseada de los geles que se sintetizan, calcular (mediante un programa de hoja de cálculo como Microsoft Excel), el peso de polímero y reticulante necesario. Debido a que un determinado peso de polímero debe ser disuelto en un volumen definido total para lograr la concentración deseada en los hidrogeles, reticulante y porciones de solución de polímero del volumen total de gel también se debe determinar utilizando la hoja de cálculo. Cálculos similares se hicieron en su caso fracciones de suspensión (por ejemplo, un adhesivo que contiene RGD o YGSR oligopéptido) se incorporarán antes de la reticulación.
3. Pesar la cantidad necesaria de polímero y agente de reticulación y el lugar en tubos Eppendorf. Ajuste la hoja de cálculo para el cálculo de acuerdo al peso real de polímero obtenido. (Nota: el volumen puede ser alterado para compensar la masa real de polímero y reticulante obtenida).
4. Preparar los moldes de gel usando una cuchilla de afeitar para cortar la parte superior fuera de la envueltos individualmente estéril jeringas de 1 ml desechables. Garantizar un corte plano se hace para los moldes que se utilizarán para geles photopatterned.
5. Colocar los moldes de la jeringa, tubos Eppendorf (con las tapas abiertas) y cualquier otro material necesario por debajo de una fuente de luz germicida (por lo general construido en los gabinetes de seguridad biológica) y esterilizar durante 30 minutos.

B. Preparación de la célula

1. Después de la esterilización, añada el volumen adecuado de amortiguación estéril (por hojas de cálculo, mientras que la elección de buffer puede variar, PBS y un búfer de base débil como la trietanolamina se utilizan normalmente para la reticulación de los radicales libres y Michael tipo, respectivamente) a la Eppendorf polímero y (opcionalmente) colgante fracción que se incluirán (por ejemplo, el adhesivo péptido) y agitar para disolver (en caso de agitación fuera de la envoltura de la campana estéril Eppendorf con parafilm).
2. Añadir la cantidad apropiada de la solución fracción pendiente de la solución de polímero y envolver el sello con parafilm. Agitar brevemente e incubar a 37 ° C para reaccionar (si es posible, sobre una placa de agitación rotatorio) durante la preparación de la célula. Este consiste en la reacción de un tiol de un péptido (a través del grupo cisteína) a un acrilato o metacrilato para que el péptido se incluye como un grupo pendiente en el hidrogel final.
3. Trypsinize y el recuento de las células y se separan en porciones que contiene el número apropiado para cada conjunto de geles. Por ejemplo, para un conjunto de tres geles 50 l, con una densidad de 10 millones de células / ml, separadas 1,5 millones de células en un tubo cónico individual. Se recomienda que no más de 4 geles se prepararon en un conjunto individual debido a las fechas de gelificación (nota: si la síntesis de varios conjuntos de geles, una sola Eppendorf que contiene un volumen adecuado de solución de polímero para todos los conjuntos se pueden preparar).
4. Centrifugar las células.
5. Mientras que las células están girando hacia abajo
   1. Luz inició entrecruzamiento de radicales libres: añadir un 0,5% en peso I2959 solución a la solución de polímero, igual al 10% del volumen de gel conjunto total (para una concentración final de iniciador% en peso de 0,05).
   2. Michael tipo (además) la reticulación: añadir búfer en el entrecruzamiento de lograr la solución de concentración apropiada.
   3. Para la reticulación secuencial: los geles incorporan ambos tipos de reticulación y requieren tanto de los pasos anteriores.

C. la formación del hidrogel

1. Aspirar el sobrenadante de la porción celular se centrifuga. Espere a líquido para resolver después de la aspiración inicial y volver a aspirar a eliminar los medios de comunicación tanto como sea posible sin alterar el sedimento celular.
2. Resuspender el botón celular con la solución de polímero hasta que las células se distribuyen uniformemente. Minimizar la formación de burbujas en la solución de pipeta lentamente hacia arriba y abajo (aproximadamente 10 ciclos debe ser suficiente para distribuir las células).
3. Los hidrogeles reticulación
   1. Luz inició entrecruzamiento de los radicales libres: alícuotas el volumen adecuado en moldes punta de la jeringa. Exponer las jeringas a la luz UV para la reticulación radical (por ejemplo, una exposición de 10 minutos a 365 nm, 4 mW/cm2 de luz UV es común que los polímeros de acrilato funcionalizados). Este paso se debe realizar rápidamente para minimizar la célula resolver antes de exposición a la luz UV.
   2. Michael tipo (además) la reticulación: se utiliza un orificio amplio punta de la pipeta, añada el volumen adecuado de solución de reticulante a la solución de polímero / celda, establezca la pipeta el volumen deseado gel individual, la solución de pipeta de arriba y abajo parahomogeneizar, y alícuota en los moldes punta de la jeringa. Este paso se debe realizar rápidamente para asegurar una distribución uniforme de las células. Permita 10-30 minutos (dependiendo del sistema individual) de incubación en el barrio de cultivo para la reticulación.
   3. Reticulación secuencial: Consiste en la reacción de adición tipo Michael primero y luego la exposición a la luz durante la segunda reticulación. Sólo una fracción de enlaces cruzados teórico debe hacer reaccionar durante la reticulación y luego una máscara de estéril se debe aplicar directamente a la superficie del gel antes de la exposición a la luz con unas pinzas esterilizadas. Un tinte funcionalizados (rodamina por ejemplo, methacrylated (MeRho) a una concentración final en el gel de 20 nM) también se pueden añadir a la solución inicial para visualizar el patrón, ya que se incorporan preferentemente en las regiones radicalmente reticulada del gel (Figura 2 ).

D. cultivo celular y análisis

1. Reticulación siguientes, geles sumergirse en pocillos de una placa de cultivo de tejido que contiene los medios de comunicación para la incubación y el análisis (consulte los pasos siguientes).
2. Las células se pueden visualizar la morfología con microscopía de luz (Figura 3; por lo general, los hidrogeles sintetizados son transparentes) y la viabilidad de uso de un fluorescente en vivo / muerto kit de tinción (Figuras 3 y 4). La tinción de actina celular (por ejemplo, rodamina o fluoresceína phalloidin) y núcleos (por ejemplo, 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) se puede realizar utilizando la fijación de estándares y procedimientos de permeabilización (Figura 4) con el siguiente procedimiento.
   1. Enjuague las construcciones 3X durante 5 minutos con PBS.
   2. Fix geles de incubación en un ml de formaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente.
   3. Enjuague las construcciones 3X con solución de bloqueo que contiene 3% (w / v) BSA y 0,5% (w / v) en PBS Tween.
   4. Permeabilizar la membrana con un 0,25% (w / v) de Triton X en solución de bloqueo durante 20 minutos.
   5. Enjuague las construcciones 3X con solución de bloqueo.
   6. Mancha de F-actina con 0,66 mg / ml FITC o rodamina phalloidin en solución de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente.
   7. Enjuagar 3 veces con solución de bloqueo.
   8. Tinción de los núcleos celulares con 0,4 l / ml DAPI en PBS durante 20 min.
   9. Enjuagar 3 veces con PBS.
   10. Visualizar las células mediante microscopía de epifluorescencia y confocal.
3. Proliferación de las células dentro de los geles se suele evaluar mediante ensayos disponibles en el mercado (por ejemplo ADN, total o contenidos bioquímicos). PicoGreen es un uso común y sensible ácido nucleico mancha fluorescente para la cuantificación de ADN de doble cadena (Singer et al.). Las células también pueden ser contados y normalizado a un número de control inicial utilizando los métodos de visualización se describe en el Paso 2.
4. Corte histológico y la tinción también se puede utilizar para visualizar las células y la forma de la matriz. El siguiente protocolo para la deshidratación y la sección de los hidrogeles en 3D se puede utilizar para obtener secciones transversales en láminas de vidrio:
   1. La fijación y la deshidratación
      1. Enjuague muestra 3X en PBS.
      2. Arreglo para el 5 - 30 minutos en paraformaldehído al 4%.
      3. Enjuague muestra 3X en PBS.
      4. Incubar la muestra en EtOH a 25 ° C durante 1 hora a cada uno de los siguientes EtOH (v / v) las concentraciones en el agua (en orden): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (En este punto, las muestras se puede almacenar durante la noche a 25 ° C).
   2. Compensación y la infiltración
      1. Traslado al 100% Citrisolv durante 1 hora a 25 ° C, seguido por una hora a 65 ° C.
      2. Cortar las muestras por la mitad con una cuchilla de afeitar en un plato de Petri de tal manera que la sección transversal de la muestra se expone.
      3. Traslado a la mezcla 1:1 de Citrisolv / parafina Micro-corte de 1 hora a 65 ° C.
      4. Traslado a la micro-corte de parafina 100% durante 1 hora a 65 ° C.
      5. Traslado a la micro-corte de parafina 100% durante la noche a 65 ° C.
      6. Traslado a la micro-corte de parafina 100% durante 1-2 horas a 65 ° C.
   3. Incrustación
      1. Posición ejemplar en desprendible del molde con el 100% de parafina.
      2. Coloque una pequeña cantidad de cera en la cama del molde, e inserte las dos mitades de la muestra con la sección transversal hacia abajo.
      3. Solicitar pieza superior del filtro
         1. Añadir más cera para sumergir la pieza superior y deje que endurezca durante ~ 10 minutos.
      4. Transferencia de inserta a 4 ° C refrigerador para permitir que muestra a endurecer toda la noche.
      5. Las muestras pueden ser también la seccióned al día siguiente, por lo general con un espesor de 5.10 m por cada sector mediante micrótomos disponibles en el mercado. Normalmente el molde desprendible se monta en posición vertical en la etapa de microtomo, y los controles manuales se utilizan para establecer el espesor de corte, máquina de cortar y la alineación de la muestra con la hoja.
   4. La extracción de RNA
      
      La expresión de genes también pueden ser evaluados cuantitativamente (por ejemplo, a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). El protocolo para la extracción de RNA a partir de hidrogeles en 3D, un ejemplo de lo que figura a continuación, es muy diferente del caso mucho más simple en 2D.
      1. Etiqueta de un certificado libre de RNasa tubo Eppendorf para cada hidrogel 3D y añadir 500 l Trizol ® reactivo a cada tubo.
      2. Use un mortero (triturador de tejidos) para moler manualmente los hidrogeles hasta que una solución se aclare. Molinillos de garantizar diferentes se utilizan para cada condición.
      3. Vortex cada Eppendorf durante 20 segundos para homogeneizar las muestras.
      4. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína.
      5. Enfriar las muestras en hielo durante 20 min
      6. Añadir 200 l (por ml de Trizol) cloroformo a cada muestra y mezclar.
      7. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos.
      8. Centrifugar las muestras a 12.000 xg a 4 ° C durante 15 min.
      9. Pasar la fase acuosa (capa superior clara) a los nuevos tubos Eppendorf (evitando la región interfacial y la fase inferior de color rojo, de fenol-cloroformo). ARN permanece en la fase acuosa clara.
      10. Las técnicas más comunes para el aislamiento de ARN y el almacenamiento se puede utilizar ahora.
      11. Tras la extracción de ARN, los kits disponibles en el mercado de la transcriptasa inversa y PCR en tiempo real a menudo se utilizan con algunas modificaciones (Elisseff et al. Strehin et al.).

Los resultados representativos:

Vea las figuras 2.4 (como se indica en los protocolos anteriores) para obtener resultados representativos de la visualización de los hidrogeles photopatterned y la encapsulación de células dentro de los geles.

Figura 1. Descripción del procedimiento de encapsulación en 3D. Pasos diagrama corresponden a los títulos de los protocolos de paso a paso.

Figura 2. Photopatterned hidrogel con secuencial tipo Michael polimerización entonces radical. (A) Esquema de photopatterning de un hidrogel reticulado parcialmente con la incorporación de un colorante reactivo foto. (B) o Círculo (C) la transparencia de banda máscara de la película con dibujos hidrogeles de ácido hialurónico. Rodamina Methacrylated (MeRho) se ha incorporado sólo en las regiones del gel que se expone a la luz. Las barras de escala = 100 micras.

Figura 3. Visualización de las células en hidrogel 3D. Las células madre visualizada a través de (a) o microscopía de luz (b) vivir (verde, calceína AM) y muertos (rojo, homodímero de etidio-1) tinción 24 horas después de la encapsulación en 1 millón de células / ml en un hidrogel de ácido hialurónico reticulado a través de una luz iniciado mecanismo de radicales libres. Las barras de escala = 100 micras.

Figura 4. Visualización de las células en hidrogel 3D. hMSCs teñidos para (a) las células vivas (calceína AM) o (b) celular de actina (rodamina phalloidin) y núcleos (DAPI) cinco días después de la encapsulación en 1 millón de células / ml en un hidrogel de ácido hialurónico reticulado a través de un mecanismo de tipo Michael ( la utilización de péptidos colgante adhesivo y reticulantes bifuncionales péptido proteolíticamente degradable). Las barras de escala = 100 micras.

Discussion

Los protocolos descritos representan un método simple y poderoso para encapsular las células en andamiajes de hidrogel de manera citocompatible. Estas técnicas son especialmente importantes desde terminales diferenciadas y las células madre pueden mostrar un comportamiento marcadamente diferente en 2D versus 3D microambientes. Incluso los enfoques terapéuticos que implican la implantación de materiales (por ejemplo, polimerización in situ radical), la encapsulación de células y el análisis de la viabilidad y la diferenciación puede ayudar en el proceso de desarrollo material. El proceso descrito secuencial puede ser usado para manipular el entorno espacial de hidrogel, y en consecuencia el comportamiento celular (ver Khetan et al.).

En general, el elemento más crítico de los protocolos descritos es la homogeneidad de todas las soluciones que se utilizan. En particular, la atención especial se debe tomar para asegurarse de células se distribuyen uniformemente en la solución de prepolímero, y que la solución se mezcla bien por la resuspensión de pipeta después de la adición de la solución de reticulante. No asegurarse de que esto puede conducir a la aglutinación de las células o las variaciones locales en la estructura del gel y la hinchazón.

Mientras que los protocolos que aquí se presenta se centran principalmente en el procedimiento para la encapsulación de células, es importante tener en cuenta también que la encapsulación puede requerir algunos ajustes a los protocolos de análisis que suelen ser por escrito para la siembra en 2D. Varios ejemplos se ilustra para la visualización y evaluación de las células en hidrogel.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
I2959	Reagent	Ciba Specialty Chemicals
.2 M Triethanolamine Buffer	Reagent	Sigma-Aldrich	T0449
PBS	Reagent	Invitrogen	14040-117	1x, sterile liquid
Live/Dead staining kit	Reagent	Invitrogen	L3224	Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes
Phalloidin-FITC	Reagent	Sigma-Aldrich	P5282
Rhodamine Phalloidin	Reagent	Invitrogen	R415
DAPI	Reagent	Sigma-Aldrich	D9542
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)	Reagent	Polysciences, Inc.	23591
Bovine Serum Albumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A7030
Tween 20	Reagent	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787
Citrisolv	Reagent	Fisher Scientific	22-143975
Micro-cut paraffin	Reagent	Polysciences, Inc.	24202
Trizol reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026
0.22 μm pore size nylon syringe filters	Equipment	Fisher Scientific	09-719C
1 mL disposable syringes	Equipment	BD Biosciences	309602	Cut syringes at consistent height for UV exposure
Wide orifice pipette tips	Equipment	Sigma-Aldrich	P6800
Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter	Equipment	EXFO	S1000
254 nm germicidal UV light source	Equipment			Built into most biological safety cabinets