分离纯化果蝇外周神经元
Summary
在这个视频文章中，我们目前的分离纯化的方法<em>果蝇</em>使用快速磁珠辅助细胞排序策略外周神经元。从分离的细胞获得的RNA可以很容易地用于下游应用，包括微阵列分析。
Abstract
“<em>果蝇</em>周围神经系统（PNS）是一个强大的调查功能和分子水平的神经元发育和树突形态发生的复杂过程模型。为了帮助这些分析，我们已经开发出一种称为树突分枝（DA）神经元，已被广泛用于研究树突形态发生的PNS的神经元的一个子类的隔离策略<sup> 1,2</sup>。这些神经元是非常困难的隔离作为一个纯粹的人口，部分原因是其极低的发生，他们难以达到低于强硬的几丁质的幼虫角质层位置。我们新开发的方法克服了这些挑战，是一个快速和特定的细胞抗体包被的磁珠富集。磁珠分选的研究，我们已经使用了年龄相仿的三龄幼虫，表达了小鼠CD8标记的GFP融合蛋白（<em>无人机mCD8 – GFP</em>）<sup> 3</sup>控制下的IV级树突分枝（DA）神经元特异性<em>扒手（PPK）- GAL4</em>驱动程序<sup> 4</sup>或控制的泛- DA神经元特异性GAL4<sup> 21-7</sup>驱动程序<sup> 5</sup>。虽然此协议已被隔离PNS的不同的几个参数，连接到幼虫角质层的内壁细胞优化，可以使用相同的协议，以分离出许多不同的细胞类型，幼虫或蛹角质层发展（如上皮细胞，肌肉，oenocytes等），或从GAL4特定的驱动程序的表达模式后的幼虫机关的其他类型的细胞。用这种方法分离出的RNA质量高，可以很容易地用于下游基因组分析，如微阵列基因表达分析研究。这种方法提供了一个强大的新工具来进行孤立的研究<em>果蝇</em>树突分枝（DA）神经元底层树突形态发生的分子机制，从而提供了新的见解。
Protocol
Discussion
这里介绍的协议优化，坚持紧紧地使用磁珠细胞分选策略果蝇三龄幼虫角质层内表面的外周神经元的分离和纯化。虽然我们已经使用了此协议专门隔离果蝇DA能神经元，此协议的应用到其他类型的细胞，角质层中的幼虫或蛹的发展阶段，坚持以隔离（如上皮细胞，肌肉，其他的外周神经元）可适应由不同的几个参数，并使用不同的GAL4，记者UAS – mCD8 – GFP转基因标签的细胞类型或类型的利益。…
Acknowledgements
我们感谢博士。裕农一月和韦斯Grueber提供在这项研究中所使用的飞股票。作者承认托马斯F和支持这项研究的凯特米勒Jeffress纪念信托（DNC）和乔治梅森大学教务办公室（EPRI）。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
