Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Summary

Qui vi mostriamo come fare retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti.

Abstract

Trattamento farmacologico degli animali tutto è uno strumento essenziale in qualsiasi sistema modello per studi di genetica e chimica farmacologica. Per via endovenosa (ev) è spesso la forma più efficace e non invasiva di consegna di un agente di interesse. Nel pesce zebra (<em> Danio rerio</em>), Iniezione IV di farmaci è stata a lungo una sfida a causa del diametro del vaso di piccole dimensioni. Questo si è dimostrato un ostacolo significativo per l'iniezione di cellule durante il trapianto di cellule staminali emopoietiche. Storicamente, le iniezioni nel sangue sono state fatte direttamente al cuore. Tuttavia, questa intra-cardiaca procedura ha un tasso di mortalità molto alto, come il cuore è spesso perforato durante l'iniezione di lasciare il pesce a rischio di infezione, perdita massiccia di sangue o di danno d'organo fatale. Basandoci sulla nostra esperienza con il mouse, abbiamo sviluppato una nuova procedura di iniezione nel pesce zebra in cui il sito di iniezione è dietro l'occhio e nel retro-orbitale del seno venoso. Questo retro-orbitale (RO), tecnica di iniezione è stato impiegato con successo in entrambi l'iniezione di farmaci nei pesci adulti, nonché il trapianto di cellule del midollo intero rene. Iniezione RO ha un tasso di mortalità molto più basso rispetto ai tradizionali iniezione intra-cardiaca. I pesci che vengono iniettati retro-orbitalmente tendono a sanguinare iniezione meno seguito e sono ad un rischio molto più basso di lesioni per un organo importante come il cuore. Altre cellule, se eseguito correttamente, iniettati e / o farmaci entrare direttamente nel flusso sanguigno che permette composti di esercitare il loro effetto sul pesce intero e le cellule renali con facilità a casa per la loro nicchia. Così, questa nuova tecnica di iniezione riduce la mortalità, consentendo una distribuzione efficiente del materiale nel sangue dei pesci adulti. Qui esemplificare questa tecnica retro-orbitale iniezione di Tg (<em> Globina</em>: GFP) in cellule adulte<em> Casper</em> Pesci così come l'iniezione di un colorante rosso fluorescente (destrano, Texas Red<em></em>) In adulti<em> Casper</em> Pesce. Abbiamo poi visualizzare le iniezioni di successo al microscopio a fluorescenza intero animale.

Protocol

Parte 1. Preparazione del materiale di iniezione Tg (globina: GFP) celle: Bleed pesce adulto donatore utilizzando punta della pipetta 10ul rivestito in eparina (1unit/ul) a pescare puntura dietro branchia. Aspirare globuli rossi e dispensare nel buffer di cella (0.9x PBS + 5% FBS + 1% Pen / Strep). Cellula sospensione filtro su mesh 40uM e determinare la concentrazione di cellule utilizzando emocitometro come precedentemente descritto da LeBlanc et al. Spin dow…

Discussion

Retro-orbitale iniezione in zebrafish adulto offre la massima efficienza della consegna del materiale iniettato alla circolazione sanguigna con la più bassa incidenza di mortalità. A causa della natura del punto di iniezione, la puntura sembra guarire in fretta, diminuendo l'insorgenza di infezioni e la quantità di perdita di sangue. Il sito può anche essere iniettato ripetutamente nel corso di un breve periodo di tempo per iniezioni giornaliere di farmaci, per esempio.

Grandi quanti…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa		Sigma-Aldrich	2106	Preweighed vial of 300 USP units
Tricaine-S		Western Chemical		MS-222
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline		Invitrogen	14190-144
Dextran, Texas Red®		Molecular Probes Inc.	D1830
E3				5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2
Microliter Syringe		Hamilton	80300	701N 10uL SYR (26s/2”/2)