규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.
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이 논문에서
요약
초록
플라즈마 막 단백질은 수용체, 이온 채널, 전송기 및 펌프로 구성된 단백질 많은 다양한 그룹입니다. 이 단백질의 활동이 양분 전달, 세포 흥분, 화학 신호를 포함한 주요 세포 행사의 다양한 책임이 있습니다. 대부분의 플라스마 막 단백질은 동적 단백질 표면 표현을 변경하여 단백질 기능을 modulates endocytic 인신 매매에 의해 규제됩니다. 단백질 endocytosis를 촉진 메커니즘은 복잡하며 충분히 많은 막 단백질에 대한 이해되지 않습니다. 완전히 주어진 단백질의 endocytic 밀매를 제어하는 메커니즘을 이해하기 위해서는 단백질의 endocytic 속도가 정확하게 측정하는 것이 중요합니다. 많은 수용체에 대한 직접 endocytic 속도 측정이 자주 표시 수용체 리간드를 활용 달성하고 있습니다. 그러나, 전송기, 펌프와 이온 채널과 같은 막 단백질의 여러 클래스에 대한, endocytic 속도를 측정하는 데 사용할 수있는 편리 리간드가 없습니다. 현재 보고서에서, 우리는 도파민 수송 (DAT) endocytic 속도를 측정하기 위하여 고용 가역 biotinylation 방법을 설명합니다. 이 방법은 국제화 속도를 측정하는 간단한 방법을 제공하며, 쉽게 대부분의 막 단백질의 밀매 연구에 대한 고용 수 있습니다.
프로토콜
절차 개요 :
이 방법을 사용하여, 세포 표면 단백질은 covalently (그림 참조 1. 인신 매매 제한 조건 (즉, 낮은 온도)에서 막 impermeant, 이황화 결합 biotinylation 시약을 (sulfo - NHS - SS - 비오틴)를 사용하여 사용 가능한 세포 리신 잔류물에 비오틴과 레이블 아르 그림에 대한). 세포 중 하나 세트 매매 허용 조건 이동 (37 ° C)와 biotinylated 단백질 internalize입니다. 세포의 다른 집합 시간 = 0 1)의 전체 표면 단백질, 그리고 2) 스트립 컨트롤에 대한 컨트롤로 저온에서 보관됩니다. 국제화의 짧은 기간에 따라, 세포가 내면화을 막을 저온으로 이동하고, 잔여 표면 비오틴은 이황화 결합 비오틴을 클리브스 감소 요원과 세포를 치료에 의해 해제 벗겨지고 있습니다. 세포 표면에서 발생한 및 internalized되었습니다 Biotinylated 단백질은 스트립 단계에서 보호하고 있으며, 남아있는 유일한 biotinylated 단백질 것입니다. 세포 용해 후, biotinylated 단백질은 streptavidin 친화도 크로마 토그래피에 의해 고립되고 관심의 단백질은 양적 immunoblotting에 의해 감지됩니다. endocytic 속도를 확인하려면, interna....
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토론
일반적인 문제 :이 실험에서 발생하는 가장 일반적인 문제는 가난한 스트립의 효율성이다. 스트립의 효율 결과를 해석하는 수있는에 중요합니다. 스트립은 매우 효율적인 게 아니라면, 그것은 국제화 차선에 biotinylated 단백질의 표면에서 internalized 사실에 있다고 결론하는 것은 불가능합니다. 스트립 ≥ 90 % 효율이 최적이며, 스트립이 수준 아래로 떨어지면면 우리는 어떤 결과를 폐기하십시오. 가난한 스트립의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 스트립 차선에있는 밴드가 꽤 볼, 34 %의 스트립 효율에 해당합니다. 가난한 스트립 효율이 발생하면, 신선한 TCEP 전에 세포에 추가 바로 만든되지 않았을 수 있습니다. 또는 TCEP가 타락 수와 새로운 시약은 구입해야합니다. TCEP 가루를 사용하면, 오히려 솔루션보다,이 문제를 우회 수 있습니다.
가능한 수정 : 현재 보고서에서, 우리는 국제화의 초기 10 분 과정을 점령 상대 DAT의 국제화 속.......
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감사의 글
이 작품은 # DA15169 앙에 NIH 교부금에 의해 투자되었다
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참고문헌
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E.
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재인쇄 및 허가
