ここで脂質中間相で手動での膜タンパク質の結晶化の試験を設定するにはカフリーの膜構造機能生物学研究グループに実装されたプロシージャが記述されています。
脂質中間相を使用して膜タンパク質を結晶化するための詳細なプロトコルが記述されています。このメソッドは、様々に脂質キュービック相としてまたはメソの方法で呼ばれています。メソッドは、X線原核生物と真核生物のタンパク質の結晶構造、単量体であるタンパク質、ホモとヘテロ多量体、発色団含有し、発色団を含まない、とアルファを解決するために使用されているという点で非常に汎用性であることが示されている-ヘリカルとβ-バレルタンパク質。 メソ結晶化に使用しての最近の成功は、人間工学的β2-アドレナリン作動性およびアデノシンA2a Gタンパク質共役受容体である。プロトコルは、モノオレインベースの中間相に膜タンパク質を再構成するため、および手動モードでの結晶化を設定するために表示されている。このような結晶の収穫など、全体的なプロセスの追加の手順は、将来のビデオの記事で対処すべきです。タンパク負荷の中間相を準備するために、手動で結晶化プレートを設定するために必要な時間は約1時間です。
立方相は、変数の数の変化で大幅に変更することができる繊細かつダイナミックな環境です。それはすべての潜在的な落とし穴を説明するマニュアルモードでのメソ結晶化試験でのセットアップの説明を与えることは不可能である。しかし、多くの困難は、高価なタンパク質溶液に適用する前に技法を実践し、そして混合時に注射器に加えられた圧力に調停を使うことによって回避することができます。正しく行えば、 メソの方法でタンパク質のさまざまな結晶を得ることができる、の数は絶えず増加しています。
メソ結晶化試験でのセットアップがここで与えられた説明は、マニュアルモードに焦点を当てています。プロセスはすることができ、多くの場合、結晶化条件の大規模スクリーニングを必要とするような場合には結晶化プレートの自動セットアップを容易にするために変更されます。
この作業に貢献し、ほとんどがカフリーの膜構造機能生物学研究グループ、両方過去と現在のメンバーからなる人も多い。すべてに私たちは暖かいおかげと感謝の意を表する。この作品は、科学財団アイルランド(07/IN.1/B1836)、国立衛生研究所(GM75915)、およびリムリック大学からの補助金によって部分的にサポートされていました。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Protein solution | Reagent | Various | Various | |
Lipid (monoolein) | Reagent | Sigma/NuCheck | Various | |
Precipitant solutions | Reagent | Various | Various | |
Purified water | Reagent | Millipore | ||
Pipetting devices | Tool | Pipetman | Various | |
Disposable pipet tips | Disposable | Pipetman | Various | |
Gas-tight syringes | Tool | Hamilton | 80265 (25-μl) | |
Syringe tips | Tool | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | |
Narrow bore coupler* | Tool | Hamilton/Emerald | various/EBS-LCP-2 | |
Repeating dispenser | Tool | Hamilton | 83700 | |
Silanized glass microscope slides | Disposable | GoldSeal | 3010 | |
microscope coverslips | Disposable | Fisher Scientific | 12-548C | |
Perforated double-stick spacer tape | Disposable | Saunders Corporation (hole-punched) | NA | |
Tweezers | Tool | Various | NA | |
Brayer (roller) | Tool | Fisher Scientific | 50820937 | |
Chipped ice | Temperature Control | NA | NA | |
Tissues | Disposable | NA | NA | |
Calculator | Tool | Various | NA | |
Lab notebook | Tool | Various | NA |
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3.