Summary

Мышиной модели CD40-активации В-клеток

Published: March 05, 2010
doi:

Summary

В этом видео мы продемонстрируем процедуру активации CD40 и расширение мышиных клеток из спленоцитов C57BL / 6 мышей, которые могут быть использованы в качестве модели антиген-представляющих клетки (АПК) для изучения индукции иммунитета.

Abstract

Исследование клеток показало, что CD40 активации улучшает их презентации антигена мощности. При стимуляции с интерлейкина-4 и CD40 лиганда (CD40L), человеческих клеток может быть расширена без трудностей из небольшого количества периферической крови в течение 14 дней до очень большого количества высоко-чистые CD40-лимфоцитов (> 10<sup> 9</sup> Клеток на пациента) от здоровых доноров, а также у больных раком<sup> 1-4</sup>. CD40-B клетки экспрессируют важно лимфатических узлов самонаведения молекул и может привлекать Т-клетки<em> В пробирке</em<sup> 5</sup>. Кроме того, они эффективно заниматься, обрабатывать и представлять антигены Т-клеткам<sup> 6,7</sup>. CD40-лимфоциты были показаны не только простые наивные, но и расширяют ячеек памяти T<sup> 8,9</sup>. Поэтому CD40-активированных В-клеток (CD40-лимфоцитов) были изучены в качестве альтернативного источника иммуно-стимулирующего антиген-представляющих клеток (АПК) для клеточной immunotherapy1, 5,10. В целях дальнейшего исследования ли-CD40 В-клеток индуцировать эффективный Т-клеточные реакции в естественных условиях и для изучения основной механизм мы создали систему культуры клеток для создания мышиной CD40-активированных В-клеток. Использование спленоцитов или очищенной В-клеток C57BL / 6 мышей для CD40-активации, оптимальные условия были определены следующим образом: Начиная с спленоцитов C57BL / 6 мышей (гаплотип H-2b) лимфоциты очищают центрифугирования в градиенте плотности и со-культивировали с HeLa клеток, экспрессирующих рекомбинантный мышиный CD40 лиганд (tmuCD40L HeLa)<sup> 11</sup>. Клетки recultured каждые 3-4 дня и ключевые компоненты, такие как CD40L, интерлейкин-4,-меркаптоэтанол и циклоспорин пополняются. В этом протоколе мы покажем, как получить полностью активирована мышиной CD40-лимфоцитов (mCD40B) с аналогичными APC-фенотип человека к CD40-лимфоцитов (рис. 1а, б). CD40-стимуляция приводит к быстрому нарост и расширения высокой чистоты (> 90%), CD19 +-клеток в течение 14 дней культуры клеток (рис. 1в, г). Во избежание загрязнения с неправительственными организациями, трансфицированных клеток, экспрессия мышиного CD40 лиганда на трансфектантов должен находиться под контролем регулярно (рис. 2). Мышиного CD40 активированных В-клеток может быть использована для изучения В-клеточной активации и дифференциации, а также исследовать их потенциал, чтобы функции, как APC в пробирке и в естественных условиях. Более того, они представляют собой перспективный инструмент для создания терапевтических или профилактических прививок против опухолей и поможет ответить на вопросы относительно безопасности и иммуногенности этого подхода<sup> 12</sup>.

Protocol

Протокол поколение мышиных CD40-активированных В-клеток (mCD40B) из спленоцитов делится на две части: часть демонстрирует подготовку мышиной CD40 лиганда (CD40L), выражающая HeLa клетки (tmuCD40L HeLa), который будет использоваться в качестве пластинчатых связаны фидерных клеток. Часть В описывает факти…

Discussion

Модификации данного протокола возможны, особенно в отношении происхождения CD40-стимул и тип мыши напряжение используется, также уступая в эффективной генерации мышиной CD40-активированных В-клеток. Ахмади соавт. показали аналогичные результаты для мышиных фибробластов, трансфицирован?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы любезно благодарит д-р Клеменс Wendtner за предоставление tmuCD40-лиганд-клеточной линии HeLa.

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium Feeder cell selection medium  
Reagent Concentration Reagent Concentration
RPMI 1640   RPMI 1640  
L-Glutamine 300 μg/mL L-Glutamine 300 μg/mL
FBS 10 % FBS 10 %
HEPES 10 mM HEPES 10 mM
Gentamycin 15 μg/mL Gentamycin 15 μg/mL
   Hygromycin B 0.2 mg/mL
mCD40-B washing medium mCD40-B culture medium
Reagent Concentration Reagent Concentration
D-MEM
D-MEM
L-Glutamine 580 μg/mL L-Glutamine 580 μg/mL
Glucose 4.5 mg/mL Glucose 4.5 mg/mL
HEPES 10 mM HEPES 10 mM
Gentamycin 15 μg/mL Gentamycin 15 μg/mL


MEM 0.1mM (1x)


FBS 10%

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent Company Order No
RPMI 1640 Invitrogen Gibco® REF 21875
D-MEM Invitrogen Gibco® REF 41965
Dulbecco´s PBS (10x) PAA Cat No H15-011
Gencin® Delta Select Art No 7395800
FBS LONZA Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Cat No S11-001
MEM NEAA Invitrogen Gibco® REF 11140
Hygromycin B PAA Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4 Immunotools Cat No 12340045
Cyclosporin A Novartis Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen Gibco® REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent Company Order No
Sterile pipette tips Sarstedt  
6-well plate NUNC Cat No 140675
50mL conical tube BD Falcon™ Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Cat No 83.1813.002

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
  2. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
  3. Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
  4. Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
  5. von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
  7. Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
  8. Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
  9. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
  10. Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
  11. Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
  12. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).

Play Video

Cite This Article
Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).

View Video