التصوير إصلاح عدم تطابق والردود الخليوي الى الحمض النووي من التلف في</em
Summary
ووصف مفصل لبروتوكول التصوير تشكيل الوقت الحقيقي من المجمعات في إصلاح الحمض النووي<emالعصوية الرقيقة></em> الخلايا.
Abstract
كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى لرد على الحمض النووي من التلف من خلال مجموعة معقدة من التغيرات الفسيولوجية. ويمكن حفز تغييرات في التعبير الجيني ، وإعادة توزيع البروتينات الموجودة ، والتجمع من البروتين مجمعات جديدة من جانب مجموعة متنوعة من آفات الحمض النووي وغير متطابقة أزواج قاعدة الحمض النووي. وقد تم استخدام المجهر مضان كأداة تجريبية قوية لتصور وقياس هذه وغيرها من الردود على آفات الحمض النووي DNA ، ورصد حالة النسخ المتماثل داخل البنية التحت خلوية معقدة للخلية الحية. وقد استخدمت متعدية اندماج بين البروتينات الفلورية مراسل ومكونات وآليات تكرار الحمض النووي لتحديد إصلاح العظة ان البروتينات التي تستهدف إصلاح الحمض النووي لهذه الآفات وما شابه ذلك<em> في الجسم الحي</em> وعلى فهم كيف يتم تنظيم هذه البروتينات داخل الخلايا البكتيرية. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت اندماج النسخي ومتعدية مرتبطة المروجين DNA محرض الضرر الذي الخلايا ضمن مجموعة من السكان من تنشيط استجابات التوتر السامة. في هذا الاستعراض ، ونحن نقدم تفصيلية لبروتوكول باستخدام المجهر مضان لصورة التجمع للإصلاح الحمض النووي DNA والمجمعات النسخ في الخلايا البكتيرية واحد. على وجه الخصوص ، هذا العمل يركز على إصلاح البروتينات التصوير تطابق ، إعادة التركيب مثلي ، تكرار الحمض النووي والبروتينات في SOS – محرض<emالعصوية الرقيقة></em>. كل الإجراءات المذكورة هنا هي قابلة بسهولة للمجمعات البروتين التصوير في مجموعة متنوعة من أنواع البكتيريا.
Protocol
Discussion
مطلوبة التجربة والخطأ لإيجاد ظروف التعرض للصور عالية الجودة لكل سلالة ، نجد أن 1 ميلي ثانية واحدة غير مناسبة للصور الضوء الأبيض ، في حين أن التعرض لل100-2000 مللي المناسبة لGFP (FITC) وFM4 64 (TRITC ) الصور. وزمن التعرض تختلف تبعا لمعدات التصوير المستخدمة. نوصي باستخدام سلالة واحدة …
Acknowledgements
الكتاب نود أن نشكر الدكاترة. Philina س. لي وألان غروسمان دال للتدريب في البداية في LAS المجهري مضان. الكتاب أيضا أن أشكر الدكاترة. ميلاني Berkmen كوباياشي وهاجيمي طلبا للمساعدة ونصائح للتصوير. وأيد هذا العمل عن طريق بدء الأموال من كلية الآداب والعلوم والآداب والعلوم من قسم علم الأحياء الجزيئية والخلوية والتنموية في جامعة ميشيغان.
Materials
Specific solution recipes1:
10x S750 salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage
100x Metals
0.2 M MgCl2
70 mM CaCl2
5 mM MnCl2
0.1 mM ZnCl2
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl3*
dH2O to final volume
*FeCl3 should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.
S750 media
1x S750 salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H2O to final volume
10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO4 (2g/L)
dH2O to final volume
Filter sterilize
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
