成像错配修复和DNA损伤的细胞反应枯草芽孢杆菌</em

Summary

一个详细的协议是描述成像的DNA修复复合物的真正形成时间<em>枯草芽孢杆菌</em>细胞。

Abstract

原核生物和真核生物都通过一个复杂的生理变化响应DNA损伤。在基因的表达，对现有蛋白质的再分配，以及新的蛋白质复合物的组装的改变，可以刺激多种DNA损伤和不匹配的DNA碱基对。荧光显微镜已被用来作为一个强大的可视化和量化这些和其他的反应，DNA损伤和监测在一个活细胞的亚细胞结构的复杂中的DNA复制状态的实验工具。荧光记者蛋白质和DNA复制和修复机制的组成部分之间的翻译融合已被用来确定的线索，其同源性病变的目标DNA修复蛋白<em>在体内</em>，并了解如何将这些蛋白质在细菌细胞内举办。此外，与DNA损伤诱导促销员的转录和翻译融合显示已激活细胞内人口的遗传毒性应激反应。在这次审查中，我们提供了一个详细的协议，用荧光显微镜图像的单个细菌细胞的DNA修复和DNA复制复合物的组装。特别是，这个工作重点成像错配修复蛋白，同源重组，DNA复制和一个SOS -诱导蛋白<em>枯草芽孢杆菌</em>。此处描述的步骤都可以适合在各种不同的细菌种类成像蛋白复合物。

Protocol

显微镜细胞成长的文化 1。前一两天，影像，准备B.枯草芽孢杆菌菌株，包含你想可视化的翻译融合蛋白。步骤1a和1b的审判轮将是必要的，以确定哪些生长条件提供最好的图像你的应变。在大多数情况下，细胞在指数生长期应成像。 对于一些B。枯草芽孢杆菌菌株（尤其是株生长不良，由于之间的兴趣和在其内源性的轨迹的绿色荧光蛋白基因的?…

Discussion

试验和错误，需要找到每一株最高质量的图像的曝光条件，我们发现，1毫秒是适当的白色光图像，而100到2000毫秒的曝光是适当绿色荧光蛋白（FITC）和FM4 – 64（TRITC ）图像。取决于所使用的成像设备，曝光时间会有所不同。我们建议每15井显微镜幻灯片应变使用最简单的成像的，垫垫边境细胞的质量和扩散可能株分化的复杂性，多株，如果是同一张幻灯片上。图像质量直接取决于琼脂糖垫细菌休息…

Materials

Specific solution recipes¹:

10x S7₅₀ salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S7₅₀ media in foil prior to storage

100x Metals
0.2 M MgCl₂
70 mM CaCl₂
5 mM MnCl₂
0.1 mM ZnCl₂
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl₃*
dH₂O to final volume
*FeCl₃ should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.

S7₅₀ media
1x S7₅₀ salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H₂O to final volume

10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO₄ (2g/L)
dH₂O to final volume
Filter sterilize