הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ"א Bacillus subtilis</em
Summary
פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן דנ"א<em> Bacillus subtilis</em> תאים.
Abstract
שני ו אאוקריוטים פרוקריוטים להגיב נזק לדנ"א באמצעות מערכת מורכבת של שינויים פיזיולוגיים. שינויים בביטוי הגנים, חלוקה מחדש של החלבונים הקיימים, ואת הרכבה של קומפלקסים חלבונים חדשים יכול להיות מגורה על ידי מגוון של נגעים דנ"א תואמים בסיס זוגות DNA. מיקרוסקופ פלואורסצנטי שימש ככלי ניסיוני רב עוצמה המאפשר הדמיה לכימות תגובות אלה ואחרים נגעים דנ"א כדי לפקח על שכפול ה-DNA מעמד בתוך הארכיטקטורה subcellular המורכב של התא החי. Fusions Translational בין חלבונים כתב ניאון ורכיבים של שכפול ה-DNA ואת מנגנון תיקון שימשו כדי לקבוע את הרמזים כי ה-DNA היעד לתיקון חלבונים נגעים שלהם מאותו מקור<em> In vivo</em> כדי להבין כיצד חלבונים אלו מאורגנים בתוך תאים חיידקיים. בנוסף, fusions תעתיק ו translational קשורה נזק היזמים ועין מתנהלת DNA חשפו שבו תאים בתוך אוכלוסיה שהפעלת תגובות דחק genotoxic. בסקירה זו, אנו מספקים פרוטוקול מפורט באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונה הרכבה של תיקון דנ"א שכפול הדנ"א קומפלקסים של תאים חיידקיים יחיד. בפרט, עבודה זו מתמקדת לתקן הדמיה חלבונים אי התאמה, הומולוגיים רקומבינציה, שכפול הדנ"א ואת החלבונים SOS-ועין מתנהלת ב<em> Bacillus subtilis</em>. כל ההליכים המתוארים כאן ניתנים בקלות מתחמי הדמיה חלבון במגוון מינים חיידקי.
Protocol
Discussion
ניסוי וטעייה נדרשים למצוא את התנאים החשיפה לתמונות באיכות הגבוהה ביותר עבור כל זן, אנו מוצאים כי 1 אלפית השנייה מתאים תמונות אור לבן, תוך חשיפה של 100-2000 ms המתאימים GFP (FITC) ו FM4-64 (TRITC ) תמונות. זמן חשיפה ישתנו בהתאם לציוד הדמיה בשימוש. אנו ממליצים להשתמש זן אחד לכל שקופית 15 ג…
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות בני הזוג. Philina ס לי אלן ד גרוסמן עבור בתחילה הכשרה LAS ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המחברים מודים גם בני הזוג. מלאני Berkmen ו האג'ימה קוביאשי לעזרה וטיפים הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי הזנק וקרנות מהמכללה, ספרות מדע אמנות מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית, נייד, ו התפתחותית באוניברסיטת מישיגן.
Materials
Specific solution recipes1:
10x S750 salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage
100x Metals
0.2 M MgCl2
70 mM CaCl2
5 mM MnCl2
0.1 mM ZnCl2
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl3*
dH2O to final volume
*FeCl3 should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.
S750 media
1x S750 salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H2O to final volume
10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO4 (2g/L)
dH2O to final volume
Filter sterilize
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
